MyD88在绵羊肺炎支原体感染过程中的作用

张俊波　印双红　易萌　陆安法

摘要：为分析MyD88在绵羊肺炎支原体（MO）感染肺泡上皮细胞中的分子机制。用不同浓度的抑制剂ST2825与细胞孵育24 h，用MTT法检测细胞活性;MO感染细胞后，于4、8、12、24 h收集细胞，利用实时定量PCR检测MyD88 mRNA的表达水平。采用不同浓度的MyD88抑制剂ST2825与细胞孵育1 h，然后用MO感染细胞，于24 h收集细胞，利用实时定量PCR检测白细胞介素-8（IL-8）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）mRNA的表达水平，用试剂盒检测caspase-3活性、caspase-8活性、H2O2浓度、NO浓度和LDH浓度变化。结果显示，MO于4、8、12、24 h显著提高细胞MyD88 mRNA表达水平;MO显著提高细胞IL-8 mRNA水平、TNF-α mRNA水平、caspase-3活性、caspase-8活性、H2O2浓度、NO浓度和LDH浓度（P<0.01），而ST2825（浓度为10 μmol/L和20 μmol/L）能够显著降低MO介导的以上指标（P<0.05），表明MyD88在MO感染肺泡上皮细胞过程中发挥重要作用。

关键词：绵羊肺炎支原体;MyD88;致病机制

中图分类号：S858.26 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）09-0197-04

山羊传染性胸膜肺炎是山羊的一种急性或慢性呼吸道传染病，主要症状为纤维素性胸膜肺炎，此病可感染各种年龄的公母羊群，有很高的发病率和死亡率，被世界动物卫生组织列入通报疫病名录，我国将此病列为二类传染病[l-4]。此病的临床特征为：高热、卡他性鼻液、眼结膜炎、纤维素性胸膜炎、母羊流产、消瘦等等。該病在世界范围内普遍流行，严重危害养羊业发展，给养羊业带来巨大的经济损失。山羊传染性胸膜肺炎在我国流行时间较长，最早在甘肃发现有此病发生，随后，在多个省份报道此病发生，例如在内蒙古、四川、云南、江苏等地[5]。在贵州的流行情况，2001年首次获得丝状支原体山羊亚种分离株[6]，2011年首次获得绵羊肺炎支原体分离株[7]。贵州白山羊的原产地和主产区位于铜仁市沿河县，在山羊疾病中传染性胸膜肺炎发病率和死亡率高，年龄在2岁内的山羊较易感染，发病率为37.7%，病死率为36.4%[8]。此病已严重危害贵州养羊业的健康发展。

TLRs是一类天然免疫受体，是高度保守的I型跨膜蛋白，为模式识别受体，是关键的天然免疫分子[9]，主要在免疫细胞和上皮细胞上表达。它通过识别病原微生物的保守结构发挥着重要作用，激活天然免疫细胞，导致一系列的机体炎症反应，在机体抵御病原微生物侵袭上发挥重要作用。TLR样受体信号通路介导多种生物学效应，如诱导炎症因子释放，诱导杀菌活性，促凋亡与抗凋亡作用等。MyD88是TLR信号通路中的关键接头蛋白，在传递上游信息和感染疾病发生中至关重要。MyD88与心血管疾病、炎症性肠病、肿瘤等疾病密切相关。

目前，由于MO对山羊肺泡上皮细胞的作用机制尚不是很清楚，本试验以探讨MyD88在MO感染山羊肺泡上皮细胞中作用机制为目的，发现MyD88在MO对山羊肺泡上皮细胞损伤中发挥重要作用，该研究为MO的致病机制研究提供理论基础和参考意见。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 支原体与细胞

绵羊肺炎支原体与山羊肺泡上皮细胞于2015年10月在铜仁市沿河县康源白山羊生态养殖农民专业合作社采集，然后将其保存于梵净山特色动植物资源重点实验室。

1.1.2 试剂

胎牛血清和DMEM细胞培养液，购自GIBCO公司;酵母提取物、蛋白胨，购自上海生工公司;Triton X-100细胞裂解液、MTT试剂盒和DMSO，购自北京索莱宝科技有限公司;caspase-3活性检测试剂盒和ST2825抑制剂，购自Apexbio公司;LDH试剂盒，购自南京建成生物工程研宄所;SYBR染料，购于罗氏公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT实验

收集对数期的山羊肺泡上皮细胞，用 0.25% 胰蛋白酶消化细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成单个细胞悬液，以每孔103～104个细胞接种于96孔培养板中，每孔总体积为200 μL，边缘孔用无菌的PBS填充。弃去上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，置摇床上低速振荡10 min，使结晶充分溶解，在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光度，具体操作见说明书。

1.2.2 细胞处理

（1）MyD88 mRNA检测组：将细胞传代于六孔板中培养，当单层细胞生长至80%覆盖度时，更换无双抗的细胞培养液，支原体 ∶细胞按10 ∶1的比例感染细胞，在5% CO2、37 ℃环境中孵育。于4、8、12、24 h 4个时间点收集细胞;（2）TNF-α mRNA、IL-8 mRNA、Caspase-3活性、Caspase-8活性、H2O2浓度、NO浓度及LDH浓度检测组：将细胞传代于六孔板中培养，当单层细胞生长至80%覆盖度时，更换无双抗的细胞培养液，将抑制剂不同浓度的ST2825与细胞提前孵育1 h，然后，支原体 ∶细胞按 10 ∶1 的比例感染细胞，在5% CO2、37 ℃环境中孵育，于 24 h 收集细胞。

1.2.3 实时定量PCR检测MyD88、TNF-α、IL-8 mRNA

MyD88 mRNA实时定量PCR检测细胞样品包括4、8、12、 24 h 4个时间点支原体感染组细胞及PBS对照组细胞。

TNF-α、IL-8 mRNA实时定量PCR检测细胞样品包括24 h一个时间点支原体感染组细胞、支原体-抑制剂ST2825（5 μmol/L）组细胞、支原体-抑制剂ST2825（10 μmol/L）组细胞、支原体-抑制剂ST2825（20 μmol/L）组细胞及PBS对照组细胞。

从NCBI网站GenBank查找MyD88、TNF-α、IL-8和 β-actin公布的基因序列，采用Primer 5.0软件设计对特异性引物（表1），引物由上海生工生物技术有限公司合成。

用Trizol一步法提取细胞总RNA，反转录合成cDNA。内参β-actin为对照，在罗氏LightCycler 480荧光定量PCR仪上进行相对定量的PCR反应，反应体系为：2×SYBR Green Master Mix 10 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL，双蒸水6 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min预变性;95 ℃ 15 s，60 ℃ （MyD88、IL-8）或61 ℃（TNF-α、β-actin） 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。每组细胞每个时间点的细胞做3个重复，样本基因MyD88、TNF-α、IL-8的表达强度用其对应的β-actin的量进行校正，即ΔCt=Ct（MyD88、TNF-α、IL-8）-CT（β-actin），相对表达量用2-ΔΔCT法对试验数据进行分析。

1.2.4 Caspase-3与Caspase-8活性检测

取细胞上清液，4 ℃，12 000 r/min离心8 min，按照试剂盒说明书检测 Caspase-3和Caspase-8活性。

1.2.5 H2O2浓度的测定

把H2O2检测试剂在冰上融解，在检测孔加入50 μL样品或标准品。在每个孔内加入 100 μL H2O2检测试剂。轻轻振荡混匀，室温放置30 min，然后立即测定D560 nm。计算出样品中H2O2的浓度，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.2.6 NO浓度的测定

取细胞上清液，4 ℃，12 000 r/min离心7 min，按照说明书检测NO浓度。

1.2.7 LDH实验

取50 μL细胞上清液测LDH的D450 nm，按照说明书进行操作。

1.2.8 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行分析，数据用均数±标准差（x[TX-*5]±s）描述，多组样本间均数用方差分析，2组间比较采用2个样本均数的t参数检验或q检验。

2 结果与分析

2.1 抑制剂ST2825对肺泡上皮细胞活性的影响

不同浓度（0、5、10、20 μmol/L）抑制剂ST2825与细胞作用24 h后，收集细胞，利用MTT方法检测细胞活性，结果表明，当抑制剂ST2825浓度为5、10、20 μmol/L不影响细胞活性（图1），可进行后续研究。

2.2 对不同时间下MO感染肺泡上皮细胞的分析

MO感染肺泡上皮细胞（MOI为10）后，提取细胞的总RNA，用实时定量PCR检测MyD88的mRNA水平。感染时间为4、8、12、24 h，结果发现，在所观察的时间点可以显著提高MyD88 mRNA表达水平（图2）。

2.3 抑制剂ST2825对MO介导的H2O2分泌影响

将不同浓度的ST2825与细胞提前孵育1 h，用MO感染细胞，在24 h检测胞内MO对细胞引起的损伤情况，结果（图3）显示，MO可显著提高H2O2分泌（P<0.01），抑制剂ST2825在 10 μmol/L 和20 μmol/L浓度下可以显著降低MO介导的H2O2分泌（P<0.05），表明ST2825可以降低MO引起的细胞损伤。

2.4 ST2825对MO介导的caspase-3和caspase-8活性的影响

进一步检测ST2825对MO介导的caspase-3和 caspase-8活性的影响，将不同浓度ST2825与细胞提前孵育1 h，再用MO感染细胞24 h，检测caspase-3和caspase-8的活性。结果显示，MO可极显著提高caspase-3（图4-A）和caspase-8（图4-B）的活性（P<0.01），而ST2825在浓度 10 μmol/L 和20 μmol/L时能够显著降低MO介导的 caspase-3（图4-A）和caspase-8（图4-B）的活性（P<0.05）。

2.5 ST2825对MO介导的TNF-α与IL-8 mRNA表达的影响

由图5可知，将不同浓度的ST2825与细胞提前孵育1 h，用MO感染细胞，在24 h检测胞内MO对细胞TNF-α与 IL-8 mRNA的影响发现，MO感染细胞组TNF-α（图5-A）与IL-8（图5-B）mRNA表达水平极显著高于对照组（P<0.01），ST2825在10 μmol/L和20 μmol/L浓度下可显著降低MO介导的TNF-α（图5-A）与IL-8 mRNA（图5-B）表达水平（P<0.05），表明ST2825可以降低MO引起的炎症因子 TNF-α与IL-8 mRNA的表达。

2.6 ST2825对MO介导的NO的影响

将不同浓度的ST2825与细胞提前孵育1 h，然后，用MO感染细胞，在24 h检测胞内MO对细胞引起的损伤情况显示，MO感染细胞组NO水平极显著高于对照组（P<0.01），而抑制剂ST2825在10 μmol/L和20 μmol/L浓度下可以显著降低MO介导的NO分泌（P<0.05），NO是一个非常关键的信号分子，在细胞凋亡过程中起重要作用，结果表明抑制剂ST2825可以降低MO引起的凋亡相关基因NO的表达（图6）。

2.7 ST2825对MO介导的LDH的影响

由图7可知，将不同浓度的ST2825與细胞提前孵育1 h，用MO感染细胞，在24 h检测培养液上清液中LDH水平，结果显示，MO感染细胞组LDH水平极显著高于对照组（P<0.01），而抑制剂ST2825在10 μmol/L和20 μmol/L浓度下可以显著降低MO介导的LDH（P<0.05）。结果表明，MO可引起肺上皮细胞崩解，ST2825可以降低MO引起的细胞崩解度。

3 讨论

TLRs属于一种模式识别受体，可识别病原体的相关分子

模式，识别的范围很广，主要包括脂质类、碳水化合物和脂蛋白等结构，是连接非特异性免疫和特异性免疫应答的一个桥梁[10]。TLR4是TLRs其中的成员，它是通过活化前炎症事件的一系列信号对病原生物所进行的应答，而脂多糖是TLR4配体有效的激动剂[11]。当被感染肺炎支原体后，就会激起宿主体内的免疫应答[12]，而天然免疫系统又是宿主抵御病原入侵的第一道防线，其中TLR在其中发挥着主要作用。支原体可激活宿主細胞Toll样受体（TLR）信号通路，致使细胞释放大量的TNF-α和IL-1等因子的释放[13]。本研究表明，在抑制剂ST2825的作用下，可以抑制支原体介导的TNF-α mRNA表达水平。

MyD88依赖性途径是所有的TLR配体所介导的一个关键通路，而MyD88非依赖性途径是TLR3和TLR4专有的信号传导途径的通路。MyD88与TLRs相互作用后，募集IRAK家族蛋白。但在外源刺激下由配体激活后，IRAK-4发挥致IRAK-1磷酸化的激酶作用，磷酸化的IRAK-1继而与MyD88作用。此时，MyD88的TIR结构域与受体发生结合，N端的DD结构域与TRAF6、IRAK-1和IRAK-4复合体共同结合至受体上。而IRAK-1和TRAF-6发生磷酸化反应活化后与MyD88发生解离反应。

caspases家族存在于绝大多数哺乳类细胞中，其中caspase-3与caspase-8在caspase级联反应中作用至关重要，是导致细胞凋亡的关键途径和所有凋亡信号传导的共同通路[14-15]。caspase-8是细胞凋亡步骤中的起始因子，可以直接活化下游效应分子caspase-3。而caspase-3位于细胞凋亡级联反应的下游，也是细胞程序性死亡的关键因子[16]。本试验结果显示，MO可显著提高caspase-3的活性，而ST2825能够显著降低caspase-3的活性，消弱MO对 caspase-3活性的促进作用。

不同浓度下的NO存在促进细胞凋亡和抑制细胞凋亡双重作用。己有研究发现支原体不仅介导宿主发生免疫反应，同时也可引起单核细胞和巨噬细胞坏死或凋亡发生[17]。细胞凋亡是通过级联反应与细胞因子变化致细胞死亡的过程。NO作为参与宿主各种生理和病理过程的多功能因子，低浓度的NO，可保护细胞免受凋亡，但NO的分泌过多可导致多种类型细胞发生凋亡。此外，多种支原体能够通过分泌过量NO来诱导细胞凋亡[18-19]。而NO的表达是由低剂量抑制因子一氧化氮合酶（NOS）所控制的[20]，过量的NO与超氧阴离子自由基形成过氧亚硝酸盐，从而活化细胞凋亡的级联反应[21]。

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