1株大蒜内生真菌的分离鉴定及抗病原真菌活性

范飞　李乐溪　鞠秀云　苏奕人　蒋继宏　杨绪勤

摘要：大蒜（Allium sativum L.）为百合科葱属多年生草本植物，富含生物活性成分及营养物质。采用组织分离法对新鲜健康的大蒜蒜瓣进行内生真菌的分离纯化，获得一株乳白色真菌KLBMPGC013;通过形态特征和ITS序列分析鉴定该菌株为白地霉（Geotrichum candidum）;將该菌株菌悬液接种在健康大蒜蒜瓣上进行培养，大蒜蒜瓣未出现明显病斑，说明该菌株对大蒜无致病性影响;以4种植物病原真菌为指示真菌检测该菌株的抑菌活性，结果显示，该菌株能抑制2种指示真菌的生长;采用蒽酮硫酸法检测该菌株产胞外多糖含量，结果显示，其胞外多糖浓度为2.89 mg/mL。通过提取该菌株胞外粗多糖并检测其抑菌活性发现，该内生真菌粗多糖对大蒜白腐小核菌的抑制作用较好，对西瓜壳二孢稍有抑制作用。

关键词：大蒜;白地霉;抗病原真菌活性;分离纯化;ITS序列分析

中图分类号：S182 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）09-0156-04

植物内生真菌是生活在健康植物组织内部并不表现出外在症状的微生物，它们从寄主植物上获得营养和保护，而寄主植物可以从增强的竞争能力和对草食动物、病原体和各种非生物胁迫的抗性中受益，具有丰富的生物多样性[1-2]。植物内生真菌已知的种类繁多，而且还有许多植物内生真菌有待开发和研究，是新型的药物资源，具有潜在的应用价值。近年来的研究表明，几乎所有植物体内都存在着内生真菌，它们主要生长在植物的根、茎、叶、果实和种子等器官的皮下组织中。植物内生真菌和宿主植物协同进化、互惠共生[3-4]，它们可以产生大量对现代医学、农业和工业有潜在应用价值的次生代谢产物，包括新型抗生素、抗药物、免疫制剂和抗癌化合物等[5-6]。汪涯等从蛇足石杉叶片中分离的内生真菌产生的黄曲霉具有抗老年痴呆和显著提高记忆力的功效[7]。一些药用植物内生真菌还可以产生抗肿瘤活性物质，研究人员从白苞蒿[8]、碱蓬[9]、海南粗榧[10]等药用植物中分离出了能产生抗肿瘤活性物质的内生真菌。

大蒜（Allium sativum L.）属于百合科葱属，有“天然抗生素”的美称，是重要的药食同源植物[11]。大蒜中含有丰富的大蒜素、大蒜多糖、蒜氨酸酶等对人体健康十分有益的成分，已有研究证明，大蒜具有降血脂、降血糖、增强免疫力、防癌抗癌、延缓衰老等重要的生理功能，且在食品、药品以及化妆品领域具有广阔的应用潜力[12-13]。目前，关于大蒜的研究热点主要集中在大蒜提取物和杀菌抑菌方面，而对大蒜内生真菌的研究还有待深入。本研究从新鲜大蒜蒜瓣中分离得到一株内生真菌，研究该真菌抑制植物病原菌活性以及产胞外多糖的能力，提取该真菌胞外粗多糖并检测其抑菌活性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物样品

本试验所用大蒜采自江苏省徐州市邳州市宿羊山镇大蒜种植基地。本试验所用大蒜个头大、品质好、肉质脆、无虫孔及病害症状，有地域特色，具有说服力。

1.1.2 培养基

分离纯化培养基——马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基配方：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，去离子水1 L，琼脂20 g，pH值自然。

对照培养基——LB固体培养基配方：胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母浸出粉5 g，去离子水1 L，琼脂20 g，pH值为7.0～7.2。

富集培养基——马铃薯葡萄糖（PD）液体培养基配方：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，去离子水1 L，pH值自然。

1.1.3 目标菌株 试验所用植物病原真菌有白腐小核菌（Sclerotium cepivorum Berk.）、茄链格孢（Alternaria solani）、苹果轮纹病菌（Physalospora piricola）、西瓜壳二孢（Ascochyta citrullina Smith），均由江苏师范大学江苏省药食植物生物技术国家重点实验室提供。

1.1.4 Sevag试剂的配制 三氯甲烷与正丁醇体积比为 4 ∶1。

1.1.5 试验仪器

GC-250型恒温光照培养箱（上海悦丰仪器仪表有限公司）;HZP-250型全温振荡培养箱（上海福玛实验设备有限公司）;UV-8000A型双光束紫外可见分光光度计;DC-52生物显微镜。

1.2 试验方法

1.2.1 大蒜内生真菌的分离纯化

采用组织切块法对大蒜进行内生真菌分离[14]。将新鲜大蒜去皮后，用去离子水冲洗10 min，在无菌环境下将大蒜用次氯酸钠溶液浸泡5 min，75%乙醇漂洗20 s，无菌生理盐水冲洗2次，无菌水冲洗1次。取最后1次冲洗的无菌水100 μL涂布在LB固体培养基上，37 ℃下培养1 d，如无菌生长，表明表面消毒成功，可进行后续试验。将经过表面消毒处理的大蒜样品在无菌环境下切成约0.5 cm3的小组织块，均匀嵌插进PDA培养基中，28 ℃下培养7～10 d后，从分离平板上挑取真菌菌落接种在新的分离纯化培养基上，28 ℃下培养3～5 d。反复进行纯化培养，直至获得单一菌株，进行常规保种、备用。

1.2.2 菌种鉴定

将分离得到的1株可产生胞外多糖的菌株在PDA培养基上进行培养，观察菌落特征。挑取该菌株纯培养产孢的内生真菌制片，在显微镜下观察其形态特征。提取该菌株总DNA，采用ITS全序列通用引物进行PCR扩增，产物测序后将ITS全序列在NCBI网站中进行Blast比对分析;用MEGA 5软件构建系统发育树。

1.2.3 菌株潜在致病性测定

将培养5 d的菌株用无菌水制成菌悬液，在550 nm处测定吸光度。将新鲜健康的大蒜蒜瓣以分离内生菌的方式进行表面消毒。在无菌环境下用消毒刀片在大蒜蒜瓣上横向划3道刀口，分别涂上该菌株菌悬液，以无菌水作对照[15]。在无菌培养皿中平铺脱脂棉，喷无菌水保湿，将处理过的蒜瓣铺在培养皿上培养，共作5个平行样。28 ℃下培养7 d，每天观察蒜瓣变化，是否出现病变。

1.2.4 抑菌活性检测

以白腐小核菌、茄链格孢、苹果轮纹病菌、西瓜壳二孢4种植物致病真菌为指示真菌，用0.5 cm打孔器制成菌饼。利用平板对峙法，挑取一块菌饼放置在PDA培养基一侧，在距离菌饼3 cm处接种“1.2.2”节中的内生真菌，于 28 ℃ 培养5～7 d，观察内生真菌是否抑制指示真菌生长。

1.2.5 胞外多糖含量测定——蒽酮硫酸法

胞外多糖的制备：挑取一块菌体于300 mL PD液体培养基中，28 ℃摇床培养2 d制成种子液。分别吸取1%种子液于500 mL PD液体培养基中，28 ℃摇床培养7 d，共发酵10 L。将发酵液于离心机中4 000 r/min离心5 min，得到的上清液即是含胞外多糖的溶液。

葡萄糖标准曲线制作：准确称取葡萄糖0.01 g溶于 100 mL 去离子水中，制备葡萄糖标准品溶液;准确称取0.1 g蒽酮溶于50 mL浓硫酸中，制备蒽酮硫酸溶液。从葡萄糖标准品溶液中分别吸取50、100、200、300、400、600、800 μL，置具塞刻度试管中，分别加去离子水定容至1 mL。以葡萄糖溶液 ∶蒽酮硫酸溶液（体积比）为1 ∶3的比例在每瓶葡萄糖溶液中加入3 mL蒽酮硫酸溶液。摇匀后100 ℃水浴加热 15 min，取出后迅速冷却至室温。以去离子水为空白对照，在最大吸收波長（620 nm）处测定相应的吸光度，每个浓度测3次。以吸光度为纵坐标、葡萄糖质量浓度为横坐标绘制葡萄糖标准曲线。

待测菌株胞外多糖溶液的配制：吸取50 μL内生真菌胞外多糖溶液溶于950 μL去离子水中，稀释20倍，然后加入 3 mL 蒽酮硫酸溶液混匀，共测3个平行样。

胞外多糖含量的测定：将待测溶液于100 ℃条件下水浴中加热15 min，取出后迅速冷却至室温。以去离子水为空白对照，在最大吸收波长（620 nm）处测定相应的吸光度，并通过绘制的葡萄糖标准曲线计算该内生真菌胞外多糖含量。

1.2.6 内生真菌胞外多糖的粗提取

收集胞外多糖溶液，将10 L体积溶液浓缩至1 L。加入4倍体积的95%乙醇混合后静置一夜，之后离心，保留沉淀。用5体积的去离子水将沉淀复溶、离心，取上清。加入占该上清溶液体积1/4的Sevag试剂高速搅拌20 min后倒入分液漏斗中，待分层后留上清，并将该步骤重复3次。加入4倍体积的95%乙醇，用布氏漏斗过滤，保留沉淀。用95%乙醇在布氏漏斗上洗涤沉淀2次，自然挥发乙醇，即得到粗多糖。

1.2.7 内生真菌粗多糖的抑菌活性检测

取10 mg粗多糖溶于1 mL去离子水中，用0.22 μm滤头过滤成无菌溶液。在PDA平板内1侧放置1枚无菌牛津杯，加入100 μL粗多糖溶液，在距离牛津杯3 cm处接种1块植物病原菌菌饼，28 ℃下培养7 d，观察内生真菌粗多糖是否抑制指示真菌生长。

2 结果与分析

2.1 大蒜内生真菌的分离

采用组织切块法对大蒜蒜瓣进行内生真菌分离，在进行反复纯化后共获得纯培养内生真菌9株，发现其中1株真菌KLBMPGC013可产生胞外多糖，因此将该菌株作为进一步研究的大蒜内生真菌菌株。

2.2 菌株鉴定

2.2.1 形态特征

由图1可知，菌株KLBMPGC013在PDA培养基上生长状况良好，菌株为乳白色，绒毛状，孢子发达。通过光学显微镜观察该菌株孢子形状为椭圆形（图2）。

2.2.2 菌株的分子鉴定

将内生真菌KLBMPGC013的ITS序列测定结果提交至GenBank数据库中，登录号为KY103456.1。将菌株KLBMPGC013的DNA序列与GenBank中相关序列进行Blast序列相似性比对，采用MEGA 5软件构建系统发育树，对其进行分析。由图3可知，菌株KLBMPGC013与白地霉（Geotrichum candidum）的进化距离最近，因此鉴定该菌株为白地霉。

2.3 内生真菌潜在致病性分析

在培养过程中，每天对经过KLBMPGC013菌株菌悬液涂抹的蒜瓣刀口进行观察，7 d后观察发现，5组样品与对照一样，并未出现异常病斑（图4）。

将蒜瓣刀口处做切片处理，在光学显微镜下观察，结果（图5）发现，对照蒜瓣切片与接菌蒜瓣切片相比无明显差异，这均说明该菌株对大蒜无致病性。

2.4 内生真菌抑菌活性检测

通过平板对峙法观察菌株KLBMPGC013对4种指示真菌生长的抑制效果，发现该菌株可抑制白腐小核菌的生长，并出现抑菌圈;对西瓜壳二孢的抑制作用较小，而对苹果轮纹病菌和茄链格孢无抑制作用（图6为菌株KLBMPGC013对大蒜白腐小核菌的抑制作用）。

2.5 内生真菌胞外多糖含量测定结果

根据葡萄糖标准曲线y=11.783 0x+0.030 8，r2=0.990 6，计算得到该菌株产多糖含量较高，为2.89 mg/mL。

2.6 内生真菌胞外粗多糖抑菌活性检测结果

通过平板对峙法观察菌株KLBMPGC013胞外粗多糖对4种指示真菌生长的抑制效果，结果显示，该菌株胞外粗多糖对大蒜白腐小核菌的抑制作用较好，对西瓜壳二孢稍有抑制效果，而对苹果轮纹病菌和茄链格孢无抑制作用（图7为菌株KLBNPGC013胞外粗多糖对大蒜白腐小核菌和西瓜壳二孢的抑制作用）。

3 结论与讨论

本研究通过对新鲜大蒜的内生真菌进行分离纯化，获得9株内生真菌，通过筛选获得1株产胞外多糖的真菌菌株KLBMPGC013。结合菌株KLBMPC013的表型特征，经ITS序列分析，将该菌株鉴定为白地霉。本研究发现，该菌株对大蒜无致病性影响且对2种植物病原真菌有抑制效果。由于该真菌产胞外多糖含量较高，因此提取该菌株胞外粗多糖并检测其抑菌活性，结果表明，该菌株具有抑菌活性是因为其胞外粗多糖具有抑菌效果。由于植物内生真菌具有稳定的生存空间、不易受外界影响，能直接作用于病原菌，在生物防治领域占有重要地位。因此对于KLBMPGC013菌株抑制植物病原真菌的效果，在后续研究中可以通过盆栽试验来进行更加准确地检测。此外，对于该菌株胞外多糖的其他生物活性也可以进行检测和深入研究。

很多药用植物具有丰富的生物多样性，是人类开发利用的重要资源。植物内生菌与药用植物的协同进化关系决定了某些内生菌具有产生与宿主植物相同或相似的生物活性物质的能力[16]。植物内生菌产生的活性物质，在农业生产、生物制药和食品发酵等方面都表现出良好的应用前景，受到广泛关注。白地霉菌具有许多可利用的价值，其菌体蛋白营养价值很高，可食用、可作饲料，也可提取核酸，还可以合成脂肪。Boutrou等研究表明，白地霉多样的代谢途径在奶酪的成熟过程中起重要作用，并通过酶活性促进奶酪风味的发展[17]。刘天明等利用白地霉发酵产品对小鼠进行急性毒性试验、骨髓细胞微核试验、小树精子畸形试验和30 d喂养试验，结果表明，白地霉菌株发酵产品具有较好的饮用安全性[18]。Assas等利用阿达玛矩阵研究发现，在优化的培养条件下，白地霉菌对橄榄油废水中化学需养量（COD）的去除率达到70%，而且废液中部分多酚化合物也被氧化降解[19]。白地霉可用于白酒生产，使原酒口感纯正、甘甜、柔软，品质得到显著改善[20]。白地霉作为一种极具潜力的菌种在多个领域都有开发利用价值，正确地运用它、挖掘它，可为我们的社会带来巨大的经济效益。

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