基于nrDNA ITS对23种兜兰属植物的分子系统学分析

刘鑫　关萍　彭昌琴　陈业　刘丽婷　陈兴银　石建明

摘要：采用PCR直接测序法，测定23种兜兰属植物的内部转录间隔区（ITS）序列，并结合GenBank中所查到的德氏兜兰（AJ564372）、波瓣兜兰（AY530916）及麻栗坡兜兰（AJ564357）的核糖体DNA（nrDNA）ITS区序列进行比对，确定23种兜兰的ITS1、5.8S及ITS2的界限。结果表明：23种兜兰植物的nrDNA ITS序列长度为717～787 bp;G+C含量为48.6%～51.5%，其中ITS1和ITS2长度分别为393～451 bp及155～180 bp，包括211个变异位点;109个信息位点。基于贝叶斯法和最大简约法构建系统聚类树，结果表明，2种方法构建的树基本一致，整个树分为2个分支3个亚组，表明基于nrDNA ITS序列能够鉴定分析兜兰属植物种间的亲缘关系。

关键词：兜兰属;nrDNA ITS;分子系统学

中图分类号： Q949.71+8.43;S184文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）09-0100-04

兜兰（Paphiopedilum Pfitz.）别称女士拖鞋兰，属兰科（Orchidaceae）中最原始的类群，与杓兰属（Cypripeium）、美洲兜兰属（Phragmipedium）被认为来自共同祖先[1-2]。全世界约有兜兰属植物80余种，主要分布于亚热带地区[3]。我国兜兰属植物资源丰富，主要分布于西南部和南部的热带与亚热带南缘地区，以云南、广西和贵州等省份分布为主[4]。由于兜兰具有极高的观赏价值和经济价值，人们对兜兰野生资源进行了毁灭性的采挖，加之生境破壞等原因，导致野生兜兰的数量急剧减少、分布区逐渐萎缩，已成为世界上最濒危的植物物种之一，所有野生种类均被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）附录Ⅰ而被禁止交易[5]。

长期以来，各种兰花由于不同地域的相互引种栽培，出现了许多同物异名和同名异物的现象，品种名和品种分类十分混乱，用传统手段进行杂种纯度鉴定很费时，而且易受环境条件的影响，所以兜兰属植物的系统分类一直存在较大争议[6-7]：基于形态学分类把兜兰属划分为3个亚属，即宽瓣亚属（Brachypetalum）、小萼亚属（Parvisepalum）和兜兰亚属（Paphiopedilum），其中兜兰亚属又分为多花型亚组（Coryopedilum）、长瓣兜兰组（Pardalopetalum）、续花型亚组（Cochlopetalum）、兜兰组（Paphiopedilum）和毛梗兜兰组（Barbata）5个组;根据叶上表面是否有网格斑把中国兜兰属植物18个原生种划分为2个亚属：兜兰亚属（Paphiopedilum）和宽瓣亚属（Brachypetalum）[8]。由此可见，兜兰变异大，中间类型多，种间的界限不是很清楚，从形态学上很难将其区分开来，为了验证兜兰属植物的系统发育关系，本研究基于nrDNA ITS序列分析技术，对我国兜兰属的不同种进行分子鉴定并进行系统发育分析，为兜兰属植物的分子系统学分析提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试兜兰属植物23个种的名称及来源见表1，所有植物标本均储藏于贵州大学植物标本馆。

1.2 主要试剂

TaqDNA聚合酶（2.5 U/μL）、反应缓冲液（10×PCR buffer）、Mg2+（25 mmol/L）、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）（2.5 mmol/L）、溴化十六烷三甲基铵（CTAB）、琼脂糖、新型核酸染料（Goldview）、1×TAE电泳缓冲液、标准分子量（Marker）均购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 试验地点与方法

1.3.1 试验时间与地点 试验于2018年3月在贵州大学生物技术实验室进行。

1.3.2 基因组DNA的提取与PCR扩增

基因组DNA的提取参照CTAB法[9]并稍作改动，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测其浓度，TE缓冲液稀释提取的DNA浓度至40 mg/L，放入-20 ℃冰箱保存。PCR扩增使用ITS通用引物F：（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），R：（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′），由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。ITS-PCR反应程序为：94 ℃预变性 4 min; 94 ℃变性30 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸 1 min，35个循环;72 ℃延伸7 min后终止反应，4 ℃保存。扩增反应结束后，取扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳1 h左右，溴化乙锭（EB）染色后用凝胶成像系统观察并拍照保存。PCR产物送生工生物工程（上海）有限公司测序，所有扩增的序列已全部提交至GenBank（表1）。

1.3.3 序列分析及系统树构建

用DNAstar[10]软件对序列进行人工校正，确定ITS-1、ITS-2和5.8S rRNA区。用Clustalx 2.0.11软件进行多重比构建矩阵并对G+C含量分析，采用贝叶斯法（BI）和最大简约法（MP）建树分析。MP树使用MEGA 5.0[11]软件分析，最大简约分析采用启发式搜索，序列矩阵中所有的碱基同等加权，并作为无序性状，空位采用缺失处理，系统树上各分支的相对支持率采用自举检验法（bootstrap）进行1 000次重复取样检验。贝叶斯分析采用MrBayes 3.2.1软件[12]运算，用Jmodeltest 2.1.7软件[13]检测并选择最优碱基替代模型，设置批处理运行代数为1 000 000代，每1 000代保留1棵树，用TreeGraph 2.0软件[14]查看BI树。

2 结果与分析

2.1 ITS区序列特征分析

将所测序列与GenBank中所查到的兜兰属瘤瓣兜兰（AJ564365）、德氏兜兰（AJ564372）、波瓣兜兰（AY530916）及麻栗坡兜兰（AJ564357）的ITS区序列进行比对，确定23种兜兰的ITS-1、5.8S及ITS-2的序列界限。23种兜兰属植物的ITS区（包括5.8 s）序列长度为717～787 bp（表2和表3），其中白花兜兰序列最长，为787 bp，紫纹兜兰序列最短，为717 bp。23个种的ITS-1长度为393～451 bp，G+C量为45.6%～49.7%，排序后长度为465个位点，其中116个为变异位点，占24.9%，59个信息位点，占12.7%;23种的ITS-2的长度为155～180 bp，相差25 bp，长度差异为8.9%，G+C量为47.5%～53.4%，排序后长度为189位点，64个变异位点，占33.9%，32个信息位点，占16.9 %;5.8S序列长度为170 bp，G+C量为54.7%～57.7%。31个变异位点，占 18.2%，18个信息位点，占13.2%，全序列排序后的长度为824 bp，其中有211个变异位点，107个为系统发育的信息位点，分别占25.6%和13.0%，这极大方便了碱基序列多态信息的判读，这对提高分子系统研究的准确性有重要作用。

2.2 遗传距离分析

利用MEGA 6.0软件的Kimura-2-parameter计算23种兜兰属植物的遗传距离，结果（表4）表明，格力兜兰和根茎兜兰之间的遗传距离值最小，为0.000，紫毛兜兰与格力兜兰和根茎兜兰之间的遗传距离值均为0.001，说明这3个种之间的亲缘关系较近;而白花兜兰与其他种之间的遗传距离值均较大，说明与其他种的亲缘关系相对较远，其中与长瓣兜兰和飘带兜兰之间的遗传距离值最大，为0.104，说明白花兜兰与长瓣兜兰和飘带兜兰之间的亲缘关系较远。

2.3 系统发育分析

基于ITS序列构建最大简约树（MP tree）和贝叶斯树（Bayes tree），2种方法构建的树基本一致（图1），分枝上面的数值分别代表后验概率和自展支持值，其中左边的数值代表BI树的后验概率值，右边的数值代表MP树的自展支持值。简约树树长为250，一致性指数（CI）为0.775 1，维持性指数（RI）为0.870 5。由图1可知，树中形成2个大支3个亚属，德氏兜兰、杏黄兜兰、麻栗坡兜兰、硬叶兜兰、白花兜兰、汉氏兜兰6个种聚为1支，支持率均大于99%，与传统的基于形态性状分类结果一致;文山兜兰、巨瓣兜兰、同色兜兰聚为1个大支，支持率均大于97%，说明他们之间的亲缘关系比较近;飘带兜兰和长瓣兜兰聚为1支，再与天伦兜兰、海伦兜兰、小叶兜兰、紫毛兜兰等16个种聚为1支，后验概率和支持率分别为80%和72%。

3 讨论

核糖体DNA（nrDNA）内部转录间隔区（Internal transcribed spacer，ITS）序列是位于rDNA编码基因18S、5.8S和28S之间的小基因片段，具有碱基变异位点多、保守性好等特点。因此被广泛用于植物属及种间的系统关系以及植物资源鉴定研究[15-16]。本研究结果表明，23种兜兰的nrDNA ITS序列长度为717～787 bp，且出现了多种变异信息位点，如 T-C、T-G、A-G之间的转换以及T-A、G-C之间的颠换，多数被检测的兜兰样本nrDNA ITS序列具有丰富的碱基变异，并且大部分变异碱基可作为其识别特征，本研究中的23条兜兰的nrDNA ITS序列中共有107个信息位点，占比 13.0%，这完全符合分子系统分析的标准，因为基因的变异在所研究的分类等级中应有5%～15%的系统发育信息位点变异，过高或过低的变异均影响分子系统分析[17]。

DNA是遗传信息的载体，是基本的进化单位，能反映进化本质，核酸的基本序列是一元变化的，通常为点突变，趋同效应极小，以核酸为指标确定的关系不受主观因素的影响，可以直接对遗传变异和进化的分子基础DNA等进行分析。DNA序列分析技术就是通过对DNA序列直接排序对比分析

[FK（W27][TPLX111.tif]

是研究遗传多样性、系统发育以及亲缘关系分析的方法。目前应用于分子系统发育分析的核基因组序列主要是在编码核糖体RNA重复区的一些序列，nrDNA ITS序列因具有科、属、种水平上的特异性和较快的进化速率，能提供较丰富的变异位点和信息位点，被广泛用于种属间遗传变异、亲缘关系以及分子系统学研究[18-19]。ITS序列在基因组中高度重复，通过基因转换及不等交换，这些重复单位已发生了位点间或者位点内的同步进化，为PCR产物的直接测序奠定了理论基础[20-21]。本研究基于ITS聚类分析结果，将23种中国兜兰属植物划分为Parvisepalum、Brachypetalum和Paphiopedilum 3个亚属，Paphiopedilum再划分为长瓣兜兰组（Pardalopetalum）和兜兰组（Paphiopedilum）2个组，这一点与Cribb的分类[7]一致，但是Cribb把紫纹兜兰（P. purpuratum）和彩云兜兰（P. wardii）划分到毛梗兜兰组（Barbata），而且认为毛梗兜兰组属于兜兰亚属，而本研究中紫纹兜兰和彩云兜兰聚为最外面，这与孙彩云等利用RAPD和同工酶研究中国兜兰属种间亲缘关系[22]一致，但不支持兜兰亚属进一步分组的说法，建议彩云兜兰和紫纹兜兰可以自成1个组，但就其分类学位置的确定还需要结合其他分子标记技术或形态学性状等进一步研究。

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