西藏林芝散养藏鸡新城疫抗体ELISA检测分析

陈家露，蔡重振，扎西卓玛，甘富斌，索朗斯珠，罗润波*

(1.西藏农牧学院 动物科学学院，西藏 林芝 860000；2.西藏林芝市农业农村局畜牧兽医总站，西藏 林芝 860000；3.西藏林芝市巴宜区农业农村局，西藏 林芝 860000)

鸡新城疫（Newcastle disease,ND），俗称亚洲鸡瘟，是由新城疫病毒（NDV）强毒所引起的鸡和多种禽类的高度接触性传染病，易感禽类常呈现败血经过。其传播速度快、四季皆发、死亡率高，对禽类养殖户造成严重的威胁与损失。20世纪80年代以来，由于疫苗的广泛使用和各种生物安全措施的不断提高，我国新城疫的流行得到了一定的控制，但无法做到全面免疫，同时免疫失败的现象屡有发生[1-2]，导致该病在我国也有流行。藏鸡作为高原特有品种，具有普遍散养、活动性强、抵抗力强等特点，虽然未见发病的报道，但仍然是新城疫的易感动物。为了解西藏林芝市散养藏鸡群新城疫的流行情况，课题组于2018年10月在西藏林芝市巴宜区藏鸡散养户中随机采集藏鸡血液并提取血清，定性检测新城疫抗体。以期对藏鸡新城疫的防控提出合理建议。

1 试验材料

1.1 仪器与试剂

无菌采血针、真空采血管、离心机（型号HD2-4）购自鸿科科技、高精度加样枪：0.5～ 10μl、10～ 100μl、200～ 1 000μl高精度加样排枪：10～100μl均购自德国艾本德股份公司、恒温培养箱、酶标仪(型号RT-2100C)购自深圳雷杜生命科学股份有限公司、鸡新城疫抗体ELISA试剂检测盒(批号HLE60097)由上海哈灵生物技术有限公司生产。

1.2 血样的采集

在西藏林芝市周边散养藏鸡户中随机抽样，采取翅下静脉血液，每羽3～4 ml，冷藏并于2 h内送回实验室[3]。

1.3 血样的处理

将所取全血在有血清析出时置于离心机中以3 000r/min，离心10 min，取上清液置于1.5 ml无菌EP管并进行编号，放置4℃冰箱备用。

2 试验方法与判断

2.1 试验方法

将冷藏试剂盒取出置于室温平衡20 min后，在 H9、H10孔中加入阳性对照50μl；H11、H12孔中加入阴性对照50μl；其余孔中依次加入待检血清，各10μl；再加入样本稀释液各40μl。在所有样本孔与阴、阳性对照孔中加入辣根过氧化酶 (HRP)标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，置于37℃恒温培养箱温育1 h。在吸水纸上拍干废液后加入洗涤液，静置1 min后再拍干，如此反复5次洗涤过程。每孔加入底物TMB各50μl，37℃避光温育15 min；最后加入终止液50μl，15 min测定其OD450nm值。

2.2 结果判断

在阳性对照孔OD值平均值≥1.00；阴性对照孔OD值平均值≤0.15时判定试验结果有效。当待检血清OD值＜临界OD值(临界OD值＝阴性对照孔OD值平均值+0.15)时判定为阴性；反之为阳性。

3 试验结果与讨论

本次共计分离得到藏鸡血清92份，根据酶标仪显示阳性对照孔的平均OD值为1.1785(＞1.00)；阴性对照孔的平均OD值为0.0955(＜0.15)；表明本次试验结果有效。计算得出临界OD值为0.2455(临界OD值＝阴性对照孔OD值平均值+0.15)，92份藏鸡血清OD值均小于临界OD值，表明本次所检测的藏鸡血清中均无新城疫抗体阳性。具体试验结果见表1。

表1 92份藏鸡血清新城疫抗体ELISA检测试验结果

酶联免疫吸附试验检测新城疫抗体是目前应用最广泛的一种方法，在ND的检测中体现了操作简便、检测量大、敏感性好的优点[4]。课题组通过ELISA试剂盒的运用，对散养藏鸡的新城疫抗体检测发现92份散养藏鸡血清中并未检测出新城疫抗体，这可能是由于西藏林芝市散养藏鸡并未感染新城疫或未接种新城疫疫苗，同时也可能是免疫维持期已过。通过课题组走访调查西藏林芝市巴宜区藏鸡散养户，发现散养藏鸡并未接种新城疫疫苗。表明在此地区散养藏鸡中无新城疫的流行。

有学者对西藏林芝市某鸡场新城疫抗体检测发现，圈养鸡免疫合格[5]。课题组通过检测发现散养藏鸡中无新城疫的流行。因此建议林市散养藏鸡户，建立严格的卫生管理制度，防止外来鸡带入病毒感染本地藏鸡，同时防止人员、来访客、饲养用具等杂物的间接传播，要严格执行卫生消毒管理制度。

散养藏鸡新城疫免疫应结合实际制定科学的免疫措施，并根据林芝当地疫病流行情况、饲养类型、母源抗体效价等具体情况来确定免疫时机与次数；一般以6～10日龄首次接种为宜，15天后进行二次免疫[6-7]；同时，要按照要求进行监测，建立和完善新城疫监测系统。