藏鸡禽流感抗体消长规律研究

凌梦娟，王一飞，贡 嘎，董海龙，田发益，吴庆侠*

（西藏农牧学院 临床兽医学重点实验室，西藏 林芝 860000）

藏鸡是我国青藏高原的地方鸡种，主要分布于我国青藏高原海拔2 200～ 4 100 m的半农半牧区、雅鲁藏布江中游流域河谷区和藏东三江中游高山峡谷区。该鸡体型轻小，胸腿肌肉发达，活泼好动，觅食能力强，极耐粗放，对高海拔地区的高寒恶劣气候条件有良好的适应能力，是发展我国高海拔地区养鸡业的重要品种资源[1-2]。

世界动物卫生组织(OIE)规定的A类传染病中，禽类烈性传染病只有两种，分别是禽流感和新城疫[3]，禽流感又叫真性鸡瘟或者欧洲鸡瘟，是一种由A型禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV) 引起的禽类的一种急性、高度致死性传染病，以急性败血性死亡到无症状带毒为特征，主要对鸡的泌尿系统、消化系统和呼吸系统产生影响，是现阶段严重威胁鸡健康生长的病毒，也曾引起过人类的感染，需要各级部门对其高度重视[4]。

禽流感给禽类养殖户带来的经济损失很大，防治禽流感的重要措施是疫苗免疫。疫苗接种后抗体产生的水平高低直接影响免疫的效果[5]。禽流感对鸡红细胞具有良好的凝集作用，检测禽流感抗体的经典实验室方法是血凝抑制试验，并被广泛使用。AIV-HI效价检测方法对疫苗免疫效果的评价和最佳免疫时机的确定都具有重要意义。ELISA检测目前已经趋于标准化，也是检测禽流感的一种常用方法，其特异性和敏感性高、成本低，已被广泛用于临床的诊断检测。为有效控制禽流感在林芝市的发生与流行，确保鸡禽流感疫苗免疫效果，本实验通过血凝抑制试验和ELLISA双重试验，探讨了禽流感抗体在藏鸡体内的消长规律，为制定西藏林芝地区藏鸡禽流感最佳免疫程序提供有效的参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 西藏农牧学院临床兽医楼养殖的86只藏鸡，并对其进行禽流感疫苗免疫接种。

1.1.2 免疫疫苗 鸡禽流感、传染性支气管炎二联活疫苗（La-sota株+H120株），批号：201631，生产日期：20170603，有效期18个月；鸡禽流感、传染性支气管炎、禽流感（H9亚型）三联灭活疫苗（La-sota株+M41株+HZ株），批号：201705，生产日期：20170616，有效期12个月；重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9-Re1株），批号：201703，生产日期：20170618，有效期：12个月；鸡禽流感、传染性支气管炎、禽流感（H9亚型）三联灭活疫苗（La-sota株+M41株+HZ株），批号：201705，生产日期：20170616，有效期：12个月。以上所有疫苗均由哈药集团生物疫苗有限公司生产。

1.1.3 免疫程序 禽流感疫苗免疫程序见表1。

1.1.4 血清样品 2018年7月20日对西藏农牧学院临床兽医楼养殖的5日龄藏鸡进行首免，2018年8月15号完成三次免疫。免疫全部结束后每隔2周随机选取20只藏鸡，翅下静脉采血2 ml。共采血14次。将采集好的血液静置30 min后，4 000 r/min，离心15 min后吸取上层血清移至灭菌的离心管中，-20℃保存备用。

1.1.5 试验仪器与试剂 鸡禽流感病毒（AIV）抗体检测试剂盒购自深圳市芬德生物技术有限公司，货号：E320106。恒温培养箱、离心机、酶标仪、振荡仪、96孔微量板、微量加样枪、微型振荡器、超纯水均由西藏农牧学院临床大楼实验室提供，鸡禽流感标准抗原，购自中国兽医药品监察所。

1.2 试验方法

1.2.1 抗体数值检测 严格按照禽流感病毒（AIV）ELISA抗体检测试剂盒说明书进行操作。

1.2.2 血凝（HA）和血凝抑制（HI）实验的检测

表1 藏鸡禽流感免疫程序

1.2.2.1 1%红细胞悬浮液的配制 随机选取1只成年藏鸡，无菌抗凝管，翅下静脉采血10 ml，1 700 r/min离心8 min，弃上层血清和白细胞层，加入15 ml生理盐水，再次1 700 r/min离心8 min，弃上清液，以上操作重复3至4次直至上清液透明。操作完毕之后，微量加样枪吸取5 μl红细胞加入495 μl生理盐水中，充分混匀，即制成1%红细胞悬浮液。放入4℃冰箱保存备用。不超过5天。

1.2.2.2 血凝（HA）试验 用96孔微量反应板，1～12孔每孔加入25 μlPBS，其中12孔为对照组。吸取25μl病毒悬液加入第1孔混匀，倍比稀释至第11孔，从第11孔吸取25μl弃去，然后每孔加入25μl的PBS，最后每孔再加入1%的红细胞悬液25μl，震荡混匀，室温静置40 min，对照孔红细胞将呈明显的纽扣状沉到孔底，观察结果。

1.2.2.3 配制4个血凝单位的抗原（4HUA） 能使红细胞全部凝集（100%凝集，＋＋＋＋）的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为一个血凝单位（HUA)。以完全血凝病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为配制含4个血凝单位抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1:256，则4HAU抗原稀释倍数应是1:64（256除以4）。

1.2.2.4 血凝抑制（HI）试验 在微量反应板上，1～11孔各加入25 μl PBS，第12孔加入50 μl PBS，然后第1孔加入25 μl待检血清，倍比稀释至第11孔，弃去25 μl，1～11孔各孔均加入上述配制的4个血凝单位的标准病毒悬液25 μl，室温静置30 min，最后每孔加入25 μl的1%鸡红细胞悬液，震荡混匀，室温静置40 min，判定结果。以完全抑制最高稀释倍数为HI滴度。通过血凝实验确定禽流感抗原的血凝效价，采用血凝抑制试验(HI)对血清样品进行禽流感抗体检测。

表2 鸡禽流感抗体合格率和抗体效价

1.3 结果判定

1.3.1 ELISA实验判定方法

实验正常的情况下，阴性对照吸光值≥1.0，阳性对照吸光值≤阴性对照吸光值×50%。

以PI值为判定结果，PI(阻断值）=（1-样品值/阴性对照孔均值）×100%，PI≥50%为阳性；PI＜50%为阴性。根据PI值高低可作为抗体水平强、中、弱的估算。

1.3.2 HA结果判断

＋＋＋＋：红细胞全部凝集，均匀铺于孔底，即100%红细胞凝集；＋＋＋：红细胞凝集基本同上，但孔底有大圈；＋＋：红细胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝块；＋：红细胞于孔底形成小圆点，四周有少许凝集块 ；－：红细胞于孔底呈小圆点，边缘光滑整齐，即红细胞完全不凝集。

1.3.3 HI结果判定

以100%抑制凝集的血清最大稀释度为该血清抗体滴度。根据GBT18931-2003《高致病性禽流感诊断技术》制定的检验规程进行判定，禽流感H1抗体效价≥4log2为免疫合格[6]。

2 结果

2.1 血凝抑制（HI）实验结果

血凝抑制实验见表2和图1。表2表明，在按程序完成三次免疫后第6周抗体合格率（100%）大于标准值70%，一直持续到第24周，第24周降至标准值以下；图1表明，在按程序完成三次免疫后第2周，抗体水平迅速上升。第10周抗体水平达到高水平并维持至第20周。直到第24周，抗体水平降至临界值附近，而第26周，抗体效价已下降到1log2，28周抗体水平几乎接近0，均表明无抗体存在。只有在第4周至第24周，检测的所有藏鸡血清中的抗体数值（PI）平均数值都在50%以上，抗体效价平均值都在4log2以上，并且抽检合格率都大于70%，符合国家农业部标准。按本防疫程序防疫禽流感后，有效抗体在藏鸡体内维持时间为5个半月。

图1 不同日期藏鸡体内禽流感抗体效价值走势

2.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）结果

ELISA结果见图2，本实验的阳性值分别为1.85635和1.7646，阴性值分别为0.6315和0.7271，阴性对照吸光值≥1.0，阳性对照吸光值≦阴性对照吸光值×50%，所以本实验成立。对每次随机试验的20只藏鸡数据进行整理取其均值，由图1可知31日龄藏鸡完成三次免疫，经2周后，抗体水平迅速上升。在第10～20周，抗体水平达到高峰，持续保持在一定水平。从20周开始时，抗体水平开始逐渐下降，直到第28周时，抗体水平降至临界值附近。

图2 不同日期藏鸡体内禽流感抗体PI值走势图

3 讨论与分析

禽流感是严重威胁养禽业发展的传染病之一，野生水禽也极易感染，人也可感染[7]。患病鸡具有典型的精神委顿，饮水量、采食量下降，流泪、肿头，眼睛不圆内有泡沫、冠发紫[8]。病鸡的体温升高, 羽毛暗淡无光, 呈现一种松乱的状态，患鸡的鸡冠颜色也变暗, 大量分泌物存在鼻腔内, 并伴有头部咳嗽、水肿以及结膜发炎症状。有些患鸡会会有抽搐、痢疾症状，产蛋量下降明显[9]。

从实验结果来看，ELISA的结果和抗血凝实验结果的走势规律是一致的。酶联免疫吸附实验（ELISA）PI数据结果显示，31日龄藏鸡完成三次免疫后的第2周，抗体才开始迅速上升。在第10周至第20周，抗体水平达到高峰，维持平稳时间长。在第28周时，抗体水平已经接近临界值。此时血凝抑制实验（HI）的抗体效价已经下降到1log2，小于农业农村部标准4log2，此时已经达不到抵抗禽流感病毒的能力，存在风险。建议进行下一次免疫。血凝抑制实验（HI）的抗体效价只有在第4周至第24周，抗体效价平均值都在4log2以上，并且抽检合格率都大于70%，符合标准，且检测的所有藏鸡血清中的抗体数值（PI）平均数值都在50%以上，数据显示禽流感有效抗体在藏鸡体内维持时间为5个半自然月。第24周（2月15日）时，酶联免疫吸附实验（ELISA）PI数据为60%，即使大于标准线50%，但此时血凝抑制实验结果的抗体效价已经接近临界值附近，应该进行下一次免疫。

禽流感血凝和血凝抑制试验是目前实验室中最常用的检测免疫抗体方法之一，但血凝和血凝抑制试验方法在操作中常有较多的影响因素，容易造成试验结果出现偏差[10]。酶联免疫吸附实验有高度的活性和灵敏性的优势，在仅做酶联免疫吸附实验（ELISA)检测禽流感抗体效价消长规律时，当PI值为60%时，需要对藏鸡进行下一次免疫，如果等PI值降至50%时，虽然结果为阳性，但此时鸡群体内的抗体已经不足以抵御禽流感病毒。所以一定要在大于标准值50%之前进行下一次免疫，以减少经济损失。

4 结论

本研究弥补国内西藏林芝地区禽流感抗体在藏鸡体内的消长规律空白，科学评价鸡禽流感疫苗的免疫效果，合理制定鸡场禽流感免疫程序。本实验采用血凝实验(HA)、血抑制实验(HI)和酶联免疫吸附实验（ELISA）方法检测藏鸡体体抗体水平。发现按本防疫程序防疫禽流感后，禽流感有效抗体在藏鸡体内维持时间为5个半自然月，建议完成三次免疫程序后第24周进行下一次免疫。这为制定西藏林芝地区最佳藏鸡禽流感免疫程序提供有效的参考依据。