细鳞鲑疖疮病的病原鉴定及防治药剂筛选

韩姝伊，魏 凯，陈春山，何亚鹏，赵宝华，何宏轩

(1.河北师范大学生命科学学院,河北 石家庄050024；2.中国科学院动物研究所,北京 朝阳100101；3.北京市水生野生动植物救护中心,北京 延庆102110)

细鳞鲑(Brachymystax Lenok)又名细鳞鱼,属于鲑形目(Salmoniformes)鲑科(Salmonidae)细鳞鱼属(Branchymystax),是我国名贵的冷水性经济鱼类[1]。细鳞鲑在我国北方分布较为广泛,主要有东北地区的黑龙江流域、图门江等,华北地区的北京、河北北部白河上游、滦河上游,以及西北地区的新疆、陕西秦岭等地[1]。在国外,还见于俄罗斯的西伯利亚、蒙古和朝鲜的河流之中。细鳞鲑已被列为国家Ⅱ级保护动物[2],为保护和合理开发细鳞鲑资源,已经开展了细鳞鲑的人工繁育和养殖。近年来,随着养殖规模的扩大,养殖过程中病害频发[3-4],造成的损失日益严重。

2017 年7 月,北京市水生野生动植物救护中心试验养殖的细鳞鲑鱼苗突发大规模死亡,症状表现为眼球凸出,鳃丝红肿、充血,鳃盖边缘、鳍条基部充血,鳍条溃烂,部分病鱼肛门红肿。剖检可见,肠道内几乎无食物,肝脏发白并伴有出血点。为了控制该疾病的蔓延,对从自然发病的细鳞鲑肝脏、肾脏、肠道处分离得到的优势菌株的理化特性、分子生物学特性以及耐药性进行了分析,用生产上常用药物进行了治疗试验,控制了病情发展。本试验结果可为细鳞鲑细菌性疾病的诊断、防治和用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料 患病细鳞鲑采集于北京市水生野生动植物救护中心,体长3.5 ～3.9 cm,体重为0.15 ～0.25 g 左右；健康细鳞鲑,体长5 ～8 cm,体重6 ～8 g。在实验室饲养21 d 确定健康后用于回归感染试验。 养殖用水为曝气的地下水,温度10.2 ℃,pH 值=7.8,溶氧量＞10 mg/L。

1.2 细菌的分离纯化 取发病症状明显的细鳞鲑,在无菌条件下采集肝脏、肾脏、肠道,划线接种于普通营养琼脂培养基上,25 ℃倒置培养24 h,肉眼观察菌落形态、大小、颜色、隆起度等。挑取形态一致的单个优势菌落进行革兰染色,并且进行下一步的分离传代纯化培养,得到3 株优势菌株分别命名为BJSY-1、BJSY-2、BJSY-3。

1.3 回接感染试验 使用1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104CFU/mL 浓度的BJSY-1、BJSY-2、BJSY-3 菌液对健康细鳞鲑进行回归感染试验。各试验组用健康细鳞鲑10 尾。采用腹腔注射方式进行攻毒,注射剂量为0.05 mL/尾,对照组注射等量的无菌生理盐水,连续观察14 d。分别于24 h、48 h 及72 h 后观察记录死亡情况及病理症状,同时用Reed-Muench 法计算菌株半数致死量(LD50)。

1.4 细菌的生理生化鉴定 将病原菌BJSY-1 在无菌条件下穿刺接种于细菌生化鉴定管中,进行葡萄糖、枸缘酸盐等项目的生理生化特性测定,生化试验结果参照微量生化反应说明书及伯杰氏细菌鉴定手册方法进行鉴定。

1.5 16S rDNA 序列测定及系统发育分析 利用细菌16S rDNA 通用引物对BJSY-1 株16S rDNA 基因进行扩增。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后,阳性样品由北京六合华大科技有限公司进行测序。

将BJSY-1 菌株的16S rDNA 基因序列与Gen-Bank 数据库中已知的气单胞菌属不同种的水产常见致病菌16S rDNA 核酸序列比较分析,根据比对结果检索出同源性较高的序列采用Clustal W 进行多序列匹配分析,之后使用MEGA7.0 软件采用邻接法(Neighbor-Joining,N J)构建系统进化树。

1.6 药敏实验 药敏实验采用纸片扩散法进行。挑取纯化后BJSY-1 单个菌落,接种于营养肉汤中,25 ℃恒温振荡培养8 h 后使用比浊仪调节菌液浓度为0.5 个麦氏浊度,以无菌棉拭子蘸取菌液均匀涂布培养基表面,再用镊子将药敏纸片贴于MH 琼脂平板表面。25 ℃培养24 h 后测量不同药物的抑菌圈直径(mm),并根据CLSI 标准进行药敏结果判定。

1.7 病鱼器官的肝脏组织切片 分别剖取健康细鳞鲑和患病细鳞鲑的肝脏组织,经4%多聚甲醛溶液固定,常规取材,脱水,石蜡包埋,制片(4 μm厚),H.E.染色,光学显微镜观察并拍照。

1.8 药物治疗试验 根据药敏试验结果选取了四环素类的盐酸多西环素、磺胺类的磺胺对甲氧嘧啶二甲氧苄啶、喹诺酮类的环丙沙星、头孢类的头孢曲松钠以及酰胺醇类药物氟苯尼考用于药物治疗试验。试验分为10 组,每组12 条鱼,分别注射菌液浓度为1.0×106CFU/mL 的BJSY-1。在注射菌液1 d后使用5 种药物通过浸浴和口服的方式进行治疗,疗程为21 d,口服时将药物均匀地拌在饲料中制备成药物饵料。每组所用药物的用法、用量如表1所示。

表1 5 种药物的用法及用量

2 结果与分析

2.1 细菌形态特征 BJSY-1 为革兰阴性菌,在普通营养琼脂上形成圆形光滑、边缘整齐、隆起、不透明、灰白色、中等大小的菌落。

2.2 回归感染试验 3 株分离菌均对细鳞鲑有不同程度的致病性,其中BJSY-1 的致病性最强,如表2 所示。人工感染BJSY-1 后的发病细鳞鲑均表现出鳍条基部及尾柄处充血、鳍溃烂,眼球凸出,肛门红肿等症状,与自然感染的发病细鳞鲑一致。由此证明,BJSY-1 为此次细鳞鲑发病的主要致病菌,BJSY-2 和BJSY-3 为辅助致病菌。 利用Reed 和Muench 氏法计算BJSY-1 菌株的半数致死量LD50为6.97×105CFU/mL。

表2 分离菌株对细鳞鲑的致病性 (死亡率)

2.3 生理生化反应结果 菌株BJSY-1 的生化鉴定结果见表3。其主要生理生化特征为氧化酶反应阳性,不具有运动性,赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶阳性,不利用枸椽酸盐,不形成吲哚,V-P 试验阴性,能发酵葡萄糖,不能发酵蔗糖、棉子糖等。参照《伯杰氏系统细菌学手册》,将其初步判定为杀鲑气单胞菌。

2.4 16S rDNA 基因序列和系统发育进化树分析BJSY-1 菌株的PCR 产物经电泳检测,该菌株的16S rDNA 基因片段约1 500 bp(图1),测序结果表明,该片段有1 420 bp。在NCBI 上进行同源性比对,结果显示,BJSY-1 与气单胞菌属种类同源性最高。从NCBI 核酸数据库中选取气单胞菌属中的其他致病菌:嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌、中间气单胞菌等以及不同亚种杀鲑气单胞菌的16S rDNA 基因进行系统发育进化树分析,利用MEGA 7.0 软件构建进化树。结果如图2 所示,其与杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(登录号:KF:749360-1.1)聚为一分支。综合生理生化鉴定结果及16S rDNA 基因序列分析结果,可以确认BJSY-1 为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.salmonicida)。

2.5 致病菌药敏试验 BJSY.1 菌株对27 种抗菌药物的敏感性研究表明(表4),该菌株对氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、头孢呋辛、头孢哌酮、四环素、氯霉素等高度敏感；对利福平、罗红霉素、新霉素等中度敏感；磺胺甲唑、氨苄西林、万古霉素、青霉素等对该菌株无抑制效果。

表3 BJSY-1 菌株的生理生化特性

图1 菌株BJSY-1 的16S rDNA 的PCR 扩增结果

图2 分离菌BJSY-1 16S rDNA 基因序列发育进化树

表4 BJSY-1 菌株对27 种抗菌药物的敏感性试验

2.6 组织病理学 通过细鳞鲑肝脏组织切片染色,可以观察到正常的肝细胞(HC)呈圆形且排列紧密,细胞界限清楚(见中插彩版图3A)。患病鱼肝结构紊乱、细胞肿胀,有炎性细胞浸润。出现广泛的肝细胞脂肪变性,胞浆内可见圆形小脂滴,如黑色箭头所示；肝细胞核空泡化,如红色箭头所示(见中插彩版图3B)。

2.7 药物治疗结果 使用药物治疗21 d 后,治疗结果如表5 所示。与未进行治疗的患病细鳞鲑死亡情况相比较,其中第6 组的治疗效果最好。口服氟苯尼考的效果要优于浸浴,浸浴与口服环丙沙星、磺胺对甲氧嘧啶二甲氧苄啶的效果相同,而盐酸多西环素与头孢曲松钠则是浸浴效果优于口服。

表5 治疗结果

3 讨论

3.1 杀鲑气单胞菌的危害 杀鲑气单胞菌是一种发生在鲑科鱼类中的系统性疾病-疖疮病的病原体。疖疮病是一种普遍存在的疾病,它影响着世界范围内的水产养殖,可在野生和养殖、海水和淡水鲑鱼的不同生长阶段发病,其特点是发病率高,死亡率高[5]。近年来,发现杀鲑气单胞菌的宿主范围在扩大,除了鲑鳟鱼类和鲤科等鱼类外,在其他养殖品种上也发现了该病原。Fontes 等首次报道了从猪肉中分离到杀鲑气单胞菌[6],林如涛等发现重庆地区的山羊感染杀鲑气单胞菌[7]。国内发现的杀鲑气单胞菌主要在冷水鱼类上,丁雷等报道虹鳟感染杀鲑气单胞菌杀鲑亚种[8],刘艳辉等报道美洲红点鲑溃烂病的病原为杀鲑气单胞菌[9],细鳞鱼感染杀鲑气单胞菌在之前也有报道[10,15]。患病的鲑科鱼类临床症状主要表现为食欲减退,眼球突出,鱼鳍基部出血,肛门红肿。非鲑科鱼类感染杀鲑气单胞菌的症状主要为皮肤溃烂,形成脓肿。溃烂部位因鱼的种类而异,如鲤科鱼类感染杀鲑气单胞菌后除头部外身体其余部位均可发生溃烂,而牙鲆的溃烂主要发生在表皮[11]。杀鲑气单胞菌是一种条件致病菌,在鱼类受到环境胁迫时容易发病。本次疾病的暴发主要是此阶段细鳞鲑鱼苗正处在开口摄食人工饲料不久,体质较弱,抵抗力差,从而引发了杀鲑气单胞菌的感染。

3.2 杀鲑气单胞菌的鉴定 杀鲑气单胞菌根据理化特征分为5 个亚种,包括杀鲑亚种、无色亚种、杀日本鲑亚种、史氏亚种和溶果胶亚种[12]。杀鲑亚种为杀鲑气单胞菌的典型株,并与鲑鱼的全身感染有关,其他4 个亚种,以及不能归类于5 个亚种中的任何一个的分离株通常被认为是非典型株[12]。在理化特征方面,杀鲑亚种与其他亚种之间差别较大,如葡萄糖产气阳性、可以利用蔗糖、不产生吲哚等[12]。2013 年11 月,北京市水生野生动植物救护中心驯养的细鳞鲑就出现过背鳍基部出血、局部体表溃烂的症状,分离到的病原菌为杀鲑气单胞菌无色亚种[10]。把本研究中分离到的BJSY-1 与2013年得到的杀鲑气单胞菌进行比较,其理化特性、药物敏感性、16S rDNA 基因序列均不同。本研究中分离得到的杀鲑气单胞菌理化特性与杀鲑亚种的特性相符合,为了更准确地鉴定BJSY-1 的亚种,有必要通过分子生物学方法进一步确定。本研究分离的BJSY-1 的16S rDNA 基因序列与GenBank 中登录的杀鲑气单胞菌杀鲑亚种16S rDNA 基因序列一致性达到99%以上,构建的系统发育树表明,BJSY-1 株与杀鲑气单胞菌杀鲑亚种聚成一支。综合菌株的理化特性和16S rDNA 的基因序列分析,最终确定病原菌BJSY-1 为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种。

3.3 杀鲑气单胞菌的耐药性 目前国内在水产动物养殖过程中仍选用抗生素防治细菌感染,但同在一个环境长期使用一种抗生素会使细菌产生耐药性,甚至产生抗生素抗性基因,出现耐药株[14]。为了避免病原菌过快地对某些抗生素类药物产生耐药性,可以进一步研究杀鲑气单胞菌的耐药机制,并且关注养殖水体中致病菌耐药性的变化趋势,科学合理地选用药物,避免或延缓该水体中病原菌产生耐药性,也为监测养殖环境和鱼体中细菌耐药性关系提供参考。本研究中药敏试验结果表明,杀鲑气单胞菌杀鲑亚种BJSY-1 菌株对喹诺酮类、四环素类、酰胺醇类等药物高度敏感；对利福平等中度敏感；而对磺胺甲噁唑、氨苄西林、万古霉素等具有耐药性。这与2013 年在同一地点分离到的细鳞鲑源杀鲑气单胞菌无色亚种对氟苯尼考高度敏感这一结果相同,但此无色亚种对环丙沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星中度敏感,与本文结果略有差异,推测是由于亚种的不同和环境的变化引起的[10]。从患病虹鳟、北极红点鲑、美洲红点鲑和细鳞鲑中分离到的杀鲑气单胞菌杀鲑亚种均对喹诺酮类药物高度敏感,对其他药物的耐药性却不太相同[13]。本文结果与细鳞鲑源的杀鲑气单胞菌杀鲑亚种BRL-15的耐药性最为接近,对所选的绝大部分药物均比较敏感[15]。

3.4 细鳞鲑细菌性疾病的防治 目前发现的细鳞鲑细菌性疾病的致病菌主要是杀鲑气单胞菌和嗜水气单胞菌[10,16-17],患病鱼症状基本相同,主要感染鱼苗及幼鱼,发病速度快,死亡率高。 徐革锋等[3]认为,细鳞鲑疥疮病病原菌为杀鲑气单胞菌,一般只感染30 g 以上的幼鱼,可用盐酸恩诺沙星10 ～15 mg/kg·bw 预防,20 ～30 mg/kg·bw 内服治疗。李海波等[4]采用聚维酮碘(10%)10 mg/L 浸泡+每100 kg 饲料加50 g 维西安和250 g 产酶益生素内服,治疗细鳞鲑烂鳍病。本试验根据药敏试验的结果,选取了盐酸多西环素、磺胺对甲氧嘧啶二甲氧苄啶、头孢曲松钠、环丙沙星和氟苯尼考治疗感染了杀鲑气单胞菌的细鳞鲑,其中口服氟苯尼考对患病细鳞鲑的治疗效果最佳,除了在投喂药饵第一天有一条鱼死亡外,之后再没有死亡情况；浸浴盐酸多西环素的效果次之,浸浴4 d 后,细鳞鲑也基本停止死亡。此结果可为细鳞鲑养殖过程中杀鲑气单胞菌的早期预防和治疗提供一定的参考。此次患病的细鳞鲑个体很小,外观症状有的并不严重,但发病时间短,死亡率高。在细鳞鲑细菌性疾病的预防和治疗中,应该科学筛选敏感药物,有针对性的用药,并根据药物的特性进行多种药物的联合使用,再配合温和的水体消毒及鱼类免疫增强剂,达到防治细菌感染的目的。