红茂草总生物碱酸水提取工艺试验

马志宏，党 岩，苟想珍，张莉敏，刘瑞生

(甘肃省畜牧兽医研究所,甘肃 平凉744000)

红茂草[dicranostigma leptopodum(Maxim)Fedde]又名秃疮花,罂粟科(Papaveraceae)红茂草属植物,为二年生或多年生草本,有毒[1]。主要含二氢血根碱、6-丙酮基-二氢血根碱、青风藤碱、秃疮花碱、异紫堇碱、紫堇碱、N-甲基莲叶桐文碱、反式普罗托品季铵盐、顺式普罗托品季铵盐、原阿片碱和别隐品碱等生物碱[2-3]。许多学者认为红茂草的有效药用成分与其所含生物碱有关[4-10]。但由于生物碱大多难溶甚至不溶于水,这给生物碱的提取利用带来不便。本试验利用生物碱的盐酸盐易溶于水这一特性,用稀盐酸溶液进行红茂草总生物碱的提取试验,以期为红茂草的临床应用提供方便。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药品 红茂草采自甘肃平凉,自然风干,粉碎保存备用。异紫堇碱标准品(购自ABCR Gmbh&Co.K G im Schlehert 公司,批号:166401,规格:10 mg)；乙腈(上海陆忠工贸有限公司、色谱纯)。

1.1.2 试验仪器 Agilent 1100 型高效液相色谱仪由Agilent 公司生产。RE52-99 型旋转蒸发仪由上海亚荣生化仪器厂生产。UV-751GD 型紫外-可见光分光光度计由上海分析仪器厂生产。试验所用其他仪器,还有电子分析天平、电热恒温鼓风干燥箱、真空泵等。

1.2 方法

1.2.1 红茂草总生物碱提取工艺 称取红茂草粉碎样品100 g,用稀盐酸溶液加热浸提,过滤得滤液。重复浸渍3 次,合并滤液,用氨水调pH 值至8.5 ～9,滤液出现浑浊沉淀,离心,倾出上清液,收集沉淀、干燥,即为红茂草的总生物碱提取物。用重量法计算总生物碱的提取率。总生物碱提取率的计算公式:提取率(%)=最终提取物质量/生药材质量×100%

1.2.2 红茂草总生物碱提取的单因素试验 先分别提取温度、时间、pH 值和料液比4 个单因素对红茂草总生物碱提取率的影响,再从每个单因素中选出3 个较好水平进行正交试验,进而得出红茂草总生物碱酸水提取工艺的最佳参数条件。不同提取时间对红茂草总生物碱提取率的影响:固定料液比1∶30、pH 值为2、作用温度80 ℃,对红茂草粉末按酸水提取工艺分别浸提1 h、2 h、3 h、4 h、5 h,并计算红茂草总生物碱的提取率(n=3)。不同料液比对红茂草总生物碱提取率的影响:固定作用时间4 h、pH 值为2、作用温度80 ℃,料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 对红茂草粉末按酸水提取工艺进行浸提,并计算红茂草总生物碱的提取率(n=3)。不同pH 值对红茂草总生物碱提取率的影响:固定温度80 ℃、提取时间4 h、料液比1∶30,分别用pH 值为1.5、2、2.5、3、3.5 的稀盐酸溶液按酸水提取工艺进行浸提,并计算红茂草总生物碱的提取率(n=3)。不同作用温度对红茂草总生物碱提取率的影响:固定作用时间4 h、pH 值为2、料液比为1∶30,分别以50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90℃按酸水提取工艺进行浸提,并计算红茂草总生物碱的提取率(n=3)。以上述单因素试验的基础上,选用4 因素、3 水平进行正交试验[L9(34)],筛选出红茂草总生物碱酸水提取法的最佳工艺参数条件。

1.2.3 HPLC 测定优化条件下红茂草总生物碱中异紫堇碱含量 按照正交试验所确定的最佳参数条件进行总生物碱的提取,取此少量提取物,用甲醇溶解进行HPLC 检测。色谱柱:Zorbax eclipse XDB C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相:V乙腈∶V0.03mol/L磷酸二氢钠=26∶74；流速:1.0 mL/min；检测波长:210 nm；柱温:30 ℃±1 ℃；进样量:20 μL。

2 结果

2.1 作用时间对红茂草总生物碱提取率的影响结果 时间对红茂草总生物碱提取率的影响结果见图1。

图1 时间对红茂草总生物碱提取率的影响

从图1 可以看出,在固定温度、料液比、pH 值等因素的情况下,红茂草总生物碱的提取率随提取时间的增加而缓慢增加。作用1 h 的提取率为12.38%,作用5 h 的提取率为15.52%。其中作用时间3 h、4 h、5 h 的提取率波动幅度较小,可以考虑用这3 个作用时间去提取红茂草总生物碱。

2.2 料液比对红茂草总生物碱提取率的影响结果 料液比对红茂草总生物碱提取率的影响结果见图2。

图2 料液比对红茂草总生物碱提取率的影响

从图2 可以看出,在固定作用时间、温度、pH 值三因素的情况下,料液比对红茂草总生物碱的提取率影响较大。低料液比时,红茂草总生物碱提取率较低。当料液比分别在1∶30、1∶40、1∶50 时,红茂草总生物碱提取率比较高,且随着料液比比例的提高,其提取率的变化幅度并不大。考虑到节能等因素,生产上可以采用料液比1∶30 的比例进行提取。

2.3 pH 值对红茂草总生物碱提取率的影响结果见图3。从图3 可以看出,当固定温度、时间、料液比等因素时,pH 值对红茂草总生物碱提取率的影响较大。当pH 值为1.5 ～2 时,红茂草总生物碱的提取率比较高,随着pH 值的升高,其总生物碱的提取率明显下降。因此,生产上适合用pH 值为1.5 ～2 的稀盐酸进行红茂草总生物碱的提取。

图3 pH 值对红茂草总生物碱酸水提取法效果的影响

图4 温度对红茂草总生物碱酸水提取法效果的影响

2.4 温度对红茂草总生物碱提取率的影响结果 见图4。 从图4 可以看出,当固定pH 值、时间、料液比等因素时,温度对红茂草总生物碱的提取率影响较大。 当作用温度为50 ℃时,提取率为10.18%。当温度升高到90 ℃时,其提取率达到15.83%。因此红茂草总生物碱的提取率随加热温度的升高而增加。但当温度达70 ℃以上时,提取率随温度的变化幅度变小。考虑到节能环保等因素,生产上可以考虑用80 ℃去提取红茂草总生物碱。

2.5 红茂草总生物碱酸水提取法的正交试验结果 在上述单因素试验的基础上,选用4 因素,3水平进行正交试验,筛选红茂草酸水提取法的最佳提取条件,具体因素水平见表1。正交试验结果见表2。从表2 可以看出,影响红茂草总生物碱提取率因素的主次关系依次是pH 值(D)、料液比(C)、温度(A)、时间(B)。 提取率最高的参数条件是A3B3C2D1,其次为A2B2C3D1。两种条件下红茂草总生物碱的提取率分别达到16.18%和16.13%。但是A3B3C2D1 工艺参数与A2B2C3D1 相比,红茂草总生物碱的提取率相差不大,但是加热温度要提高10 ℃,作用时间要多1 h,考虑到生产中节能环保等因素,生产中宜选用A2B2C3D1 参数条件进行红茂草总生物碱的提取。

表1 正交试验因素与水平

表2 酸水提取法正交试验分析结果 [L9(34)]

2.6 红茂草总生物碱中异紫堇碱含量测定结果 异紫堇碱标准品及红茂草总生物碱色谱分析结果见图5、图6。

图5 异紫堇碱标准品色谱分析结果

图6 红茂草总生物碱色谱分析结果

由图5、图6 可知,将异紫堇碱标准品系列的色谱峰面积Y 对进样浓度进行线性回归分析,得回归方程为Y=104 699X+169.57,R2=0.999 7,线性范围为2.0 ～100.0 μg/mL；异紫堇碱标准品保留时间tR的范围为5.41 ～5.59 min。通过正交设计提取的红茂草生物碱样品在5.58 min 时出峰,峰形对称,与标样接近,经计算其中异紫堇碱含量为9.28%。

使用正交试验设计,可以减少试验次数,较全面地反映各因素水平对有效成分的提取效果。本试验通过对一系列影响因素的考察,确定了红茂草总生物碱最佳提取工艺模式为:提取温度90 ℃,提取时间5 h,料液比1∶40,pH 值1.5。通过对红茂草生物碱正交提取工艺模式的建立研究,为红茂草生物碱的提取利用提供了依据,拓展了该植物资源新产品的开发思路,为该药用资源的进一步研究提供了可能。