布鲁菌VirB1 2 基因的分泌表达及鉴定

张婷婷，刘梦志，冯 生，孙创业，陈泽良，刘宝山，沈国顺

(沈阳农业大学畜牧兽医学院,辽宁 沈阳110866)

布鲁菌病(Brucellosis,简称布病)是由布鲁菌(Brucella)引起的人兽共患慢性传染病,羊、牛、猪等动物最易感染,主要引起母畜传染性流产[1]。人类由于接触带菌动物或者食用病畜及其乳制品可引发感染[1]。目前该病流行于世界各个地方,发展中国家尤为严重。在中亚国家,人布病的流行形势在不断恶化[1-2],在我国也广泛流行。近年来,我国部分地区有再度流行的趋势[3],给人们的日常生活和生产带来了严重危害和巨大的经济损失。

布鲁菌是胞内寄生菌,抗菌药物治疗效果不显著,很难根治,这就造成了该病的反复发作[11]。目前布病的防治主要以疫苗免疫为主,然而现有的A19、S2 等弱毒苗的免疫效果不理想[4],而且疫苗免疫抗体和野毒感染抗体无法进行区分,给养殖场的布病净化带来很大困难。在这种情况下,开发新的基因缺失标记疫苗成为热点[5]。牛布鲁菌病A19-ΔVirB12 活疫苗是以A19 株为亲本株,缺失布鲁菌IV 型分泌系统中VirB12 基因的基因缺失疫苗[6-7]。免疫动物可以通过VirB12 蛋白抗体的存在与否来判断区分疫苗免疫抗体和野毒感染抗体,弥补了以往疫苗的缺陷,有利于布病的预防和净化,从而保护人的健康和安全。

VirB12 基因属于布鲁菌 IV 型分泌系统(T4SS)。 IV 型分泌系统由分别命名为VirB1-VirB12 的12 个不同的VirB 蛋白构成,形成贯穿细菌壁和外膜的复合体,与布鲁菌在宿主细胞内的生存、复制、免疫应答有关[8]。VirB12 蛋白在胞内运输过程中发挥重要作用,并且可作为一种布鲁菌血清学检测标记抗原[9]。本试验构建了VirB12 的短小芽孢杆菌分泌型表达系统,用以获取大量VirB12蛋白,为建立基于VirB12 蛋白的检测方法以区分疫苗免疫抗体和野毒感染抗体提供材料。

1 材料与方法

1.1 材料 布鲁菌菌株和血清:布鲁菌标准阳性血清,购自中国生物制品鉴定所；A19-ΔVirB12 免疫阳性血清和B.abrotus A19 菌株由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司赠予。

1.2 载体及菌株 短小芽孢杆菌表达系统试剂盒(Cat.#HB300),购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 抗体及试剂 6×His 单克隆抗体、HRP 标记的蛋白G、2×Premix Taq、PVDF Immobilon-P Transfer Membranes、限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ等,购自北京全式金生物技术有限公司；HRP 标记的山羊抗牛二抗、HRP 标记的山羊抗鼠二抗、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒、胶回收试剂盒、DAB 显色试剂盒等,购自索莱宝科技有限公司。其他试剂均为国产。

1.4 方法

1.4.1 引物的设计与合成 根据NCBI 上发表的牛型布鲁菌(Brucella abrotus)VirB12 基因序列(Gen-Bank:AF226278.1),使用分子生物学软件Prime premier 5.0 设计并合成了1 对引物:VirB12-F:5′-GATGACGATGACAAAGGATCCTCTCTGGCCGCTTGTTCC-3′(ggatcc 为BamHⅠ酶切位点),VirB12-R:5′-CATCCTGTTAAGCTTGTCGACTTACTTGCGTAAAATTTCGATATCC-3′(gtcgac 为Sal I 酶切位点)。为简化试验步骤,引物两端分别设计了重组克隆序列和限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ的酶切位点。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4.2 VirB12 基因的PCR 扩增及回收 以牛布鲁菌A19 的煮沸裂解产物为模板进行VirB12 基因组的PCR 扩增,反应条件为:94 ℃预变性4 min；94 ℃变性35 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,35 个循环；72 ℃总延伸10 min。做50 μL 反应体系。反应结束后取5 μL PCR 产物进行1.5%琼脂糖核酸凝胶电泳鉴定扩增效果。

1.4.3 重组表达质粒的构建及鉴定 用琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒回收VirB12 目的条带。按照短小芽孢杆菌表达系统试剂盒的操作程序将回收好的VirB12 目的基因片段重组克隆到pBIC1 质粒上并转化到短小芽孢杆菌中,然后均匀涂布在含新霉素(50 μg/mL)的2SY 固体培养基平板。挑选克隆菌落,接种于含新霉素(50 μg/mL)的2SY 液体培养基中,37 ℃振荡培养过夜。取菌液进行质粒抽提,然后对获取的质粒进行PCR 和双酶切鉴定,鉴定正确的质粒送宝生物工程(大连)有限公司测序。

1.4.4 重组阳性菌的诱导表达 将鉴定正确的VirB12 重组表达菌株接种于4 mL 含新霉素(50 μg/mL)的2SY 液体培养基中,在30 ℃～33 ℃条件下120 r/min 振荡培养72 小时,进行诱导表达。表达结束后,取1 mL 的菌液5 000 r/min 离心5 min。分别取上清和沉淀样品,用上样缓冲溶液处理后通过15%SDS-PAGE 进行鉴定。

1.4.5 重组蛋白的鉴定 菌液上清经15% SDSPAGE 分离后,电转至PVDF 膜上,以1%的BSA 在37 ℃条件下封闭1.5 h,然后分别以6×His 单克隆抗体(1 ∶500 稀释)及牛布鲁菌阳性标准血清(1∶100 稀释)作为一抗,以HRP 标记的山羊抗鼠血清(1∶1 000 稀释)和HRP 标记的山羊抗牛血清做二抗(1∶5 000 稀释)孵育30 min,洗涤后用DAB 显色,蒸馏水终止反应。

2 结果

2.1 VirB12 基因的扩增 PCR 扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳后,在500 bp 附近出现了一条扩增条带(图1),与预期目的片段519 bp 大小相符,表明扩增出了VirB12 目的基因。

图1 B12 基因PCR 扩增产物

2.2 重组表达质粒鉴定 提取克隆菌的质粒,进行BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切和PCR 扩增,产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳分析,可看到在500 bp 附近都出现了基因片段(图2),DNA 测序结果经BLAST对比鉴定为布鲁菌VirB12 序列。

图2 pBIC1-B12 质粒的鉴定

2.3 VirB12 蛋白的诱导表达 重组菌诱导表达产物经过15%SDS-PAGE 分析显示,菌液上清中出现了特异的22 kDa 的蛋白条带(图3),与预期的目的蛋白大小相符,表达蛋白的含量高达80%。菌体沉淀中没有明显的条带出现,表明表达蛋白为分泌表达。

图3 重组阳性菌的诱导表达及鉴定

2.4 VirB12 蛋白的鉴定 分别使用6His 单抗和牛布鲁菌阳性血清做一抗的Western-Blot 结果表明,在22 kDa 处均出现了显著的免疫印迹条带(图4 A,B),位置和SDS-PAGE 电泳位置相符,而作为阴性对照的芽孢杆菌样品没有出现免疫印迹条带,表明诱导表达的蛋白为VirB12 的6×His 融合蛋白,其能与牛布鲁菌标准阳性血清发生反应,具有良好的反应原性；而以A19-ΔVirB12 免疫牛的阳性血清做一抗的Western-Blot 中没有出现该条带(未展示),说明A19-ΔVirB12 疫苗免疫的阳性血清中不含有VirB12 蛋白的抗体。

图4 B12 重组蛋白的鉴定

3 讨论

布鲁菌作为危害人兽安全与健康的病原菌之一,备受关注。布鲁菌分为六个种属19 个亚型,分别是马耳他布鲁菌(羊型布鲁菌)3 个亚型、流产布鲁菌(牛型布鲁菌)8 个亚型、猪布鲁菌5 个亚型、狗布鲁菌1 个亚型、林鼠布鲁菌1 个亚型和绵羊布鲁菌1 个亚型。而且近几年还发现了海洋种[1]。其中羊种、牛种、猪种和狗种布鲁菌能够通过受伤皮肤、黏膜直接感染人类,并引发一系列的临床症状,严重危害人们的健康。

布鲁菌是兼性细胞内寄生菌,能够感染吞噬细胞和非吞噬细胞,在感染哺乳动物时,巨噬细胞是主要的结合靶点[10]。其中T4ss 分泌系统参与布鲁菌在胞内的增殖。T4ss 分泌系统通过改变寄生细胞的细胞器来达到自我的复制[11]。VirB12 作为T4ss 分泌系统编码的一个基因,能够在感染细胞过程中产生毒性蛋白[12],并且能够产生相应的抗体,可作为血清学标记检测布鲁菌[9]。

尽管现有的A19、S2 等弱毒苗的免疫效果不理想,但使用疫苗免疫接种仍然是防控布鲁菌病最有效的方法,然而现有的疫苗无明显的基因标识,无法从血清学水平来区别野毒感染和疫苗免疫血清,在这种情况下,开发新的基因缺失标记疫苗成为热点[7]。牛布鲁菌病A19-ΔVirB12 活疫苗是以A19株为亲本株,缺失布鲁菌IV 型分泌系统中VirB12基因的基因缺失疫苗[6],填补了现有弱毒疫苗和灭活疫苗无法在血清学水平来鉴别诊断布病野毒感染的缺陷。以其为抗原建立ELISA 方法,可以在只免疫A19-ΔVirB12 活疫苗的养殖场检出野毒感染动物。A19-ΔVirB12 活疫苗和VirB12 抗体ELISA 配套使用,可以净化养殖场中的布病野毒,减少布病带来的经济损失,保障人员安全。

本试验成功构建了VirB12 蛋白的短小芽孢杆菌表达菌,可以在上清中大量表达具有反应活性的VirB12 蛋白,含量达80%,方便制备和纯化,为其应用于布病野毒的筛检做了前期准备。