紫苏叶油浸剂对早期断奶仔猪应激综合征的保护作用

景俊年，苏金辉，夏 冰，王九峰

(中国农业大学动物医学院,北京 海淀100193)

断奶仔猪面临断奶应激和突然转变为植物饲料为主的日粮等多重因素的影响,常常会引起早期断奶仔猪采食量降低、生长迟滞、消化功能紊乱等一系列征候,被称为早期断奶应激综合征(Piglets Early-weaning Synodrome,PEWS)[1-3]。这其中饲料中天然抗原的负面作用是重要因素,其中豆粕中大豆抗原蛋白及其他抗营养因子常常是重要原因[4-5]。仔猪对大豆抗原产生免疫反应,引起小肠形态结构的变化,从而破坏仔猪肠道的免疫系统,导致肠黏膜屏障功能受到破坏,引起仔猪肠道过敏反应[6]。高豆粕带来的高大豆抗原是加重仔猪早期断奶综合征的重要因素[7]。

紫苏被认为具有抗炎、抗过敏、抗氧化的活性,其挥发油被认为是主要有效成分[8]。紫苏叶粗蛋白高达20%以上,含多种氨基酸,钙磷含量较高,本身适于直接应用于饲料当中,位列“饲料原料目录-可饲用天然植物”(农业部公告,第1773 号)。同时紫苏适应性较好,在全国各地均可种植。有研究表明,紫苏叶提取物对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎症状具有明显改善效果[9]。本文拟通过建立断奶仔猪模型,系统研究豆粕中的大豆抗原对仔猪的临床及病理变化等以及紫苏叶油浸剂在该过程中所发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 21 日龄断奶仔猪18 头,体重6 kg 左右,雌雄各半。分空白对照组(CN 组)、高豆粕组(HS 组)、高豆粕加紫苏叶油浸剂保护组(PL组)；随意采食,自由饮水。

1.1.2 紫苏叶油浸剂 新鲜紫苏叶、豆油按3∶1混合后添加6%蔗糖脂肪酸酯至100%混合浸润后湿磨粉碎,30 目去除渣滓,加1.5 倍的膨化玉米制成吸附粉。

1.1.3 试验日粮 见表1。

表1 各组试验日粮及营养水平

1.2 方法

1.2.1 临床症状观察及记录 试验期间观察并记录各组仔猪的临床症状,每日早晚(8:00；20:00)各测量一次体温并记录,观察记录每头猪排出的粪便并评分。

1.2.2 粪便中肠炎标志物检测 髓过氧化物酶(MPO),α1 抗胰蛋白酶(α1AT),检测试剂盒,购自南京建成生物科技有限公司；新喋呤(NP)检测试剂盒,购自江莱生物科技有限公司；检测方法按照说明书进行。

1.2.3 组织病理切片制作及肠炎评级 仔猪屠宰后不挤压采集猪空肠、回肠各一段(约2 cm),涮洗去除肠道内容物,置于盛有4%多聚甲醛固定48 h。组织块经脱水,透明,浸蜡形成蜡块,置于切片机上制作厚度为3 μm 的切片,蜡带进行展片和烤片后进行苏木精-伊红(H.E.)染色。将制备好的肠道切片置于显微镜下观察,针对每头猪空肠、回肠的病理变化评估其肠炎情况。

2 结果

2.1 临床症状 试验期间每日测量试验猪直肠温度,各组仔猪直肠温度有升高的趋势,但是都维持在正常体温之内,之后各组仔猪直肠温度维持在39 ℃左右,各组仔猪体温无显著差异。

于试验周期内每日8:00、20:00 观察仔猪粪便状态并按照评分标准进行评价,评分为1 ～3 级时判定为未发生腹泻,4 ～6 级时判定为腹泻,统计试验期各级粪便所占比例,结果如图1 所示。

图1 腹泻比例

试验开始1 ～2 d,各组仔猪受断奶应激、运输应激及环境应激影响,出现轻微腹泻状况。经过统计学分析,HS 组腹泻频率显著高于CN 组,而PL 组与CN 组没有显著差异。

2.2 肠炎标志物检测 分别于第1、3、5、7 天无菌采集粪便,检测粪便中肠炎标志物髓过氧化物酶(MPO),α1 抗胰蛋白酶(α1AT),新喋呤(NP)水平。

图2 髓过氧化物酶MPO 表达水平

MPO 是评价炎症严重程度的重要指标,在第3天,与CN 组相比,HS 组MPO 水平有极显著性升高,而PL 组有显著性升高,同时HS 组显著高于PL 组；在第5 天,HS 组MPO 水平除显著高于CN 组外,也显著高于PL 组；在第7 天,与CN 组相比,HS 组合PL均有极显著性升高,同时,HS 组显著高于PL 组。

图3 α1 抗胰蛋白酶(α1AT)表达水平

α1AT 是抗炎症的急性期反应物,在第3、5 天,与CN 相比,HS 组有显著性升高,而PL 则没有显著性变化,同时HS 组也显著高于PL 组。

NP 与机体细胞免疫活化及炎症反应状态有关,在本试验期间,三组仔猪均没有显著性变化。

2.3 肠道病理变化 屠宰后采集三组仔猪空肠、回肠样本制作石蜡切片,H.E.染色后观察,结果见封三彩版图4。

CN 组仔猪空肠无明显病变情况。HS 组仔猪空肠绒毛高度低于CN 组,镜下可见肠上皮细胞大量坏死脱落,肠绒毛断裂,黏膜充血显著,固有层出现大量炎性细胞浸润及细胞坏死。PL 组空肠绒毛结构完整,黏膜有轻度充血,固有层有少量炎性细胞浸润。

镜下观察发现,CN 组回肠绒毛结构完整清晰,HS 组回肠上皮细胞坏死脱落,肠绒毛断裂明显,杯状细胞明显增多,黏膜中度充血,PL 组回肠绒毛结构完整清晰,杯状细胞轻微增多,固有层有少量炎性细胞浸润,黏膜轻度充血。CN 组回肠淋巴小结结构清晰正常,无明显病变,HS 组回肠淋巴小结内有大量细胞坏死崩解,淋巴滤泡排空现象明显,PP结呈重度“星空样变”,PL 组回肠淋巴小结内有轻微淋巴细胞坏死现象,PP 结呈轻度“星空样变”。与HS 组比较,PL 组回肠病变程度明显减轻,说明添加紫苏叶对大豆抗原引起的仔猪肠炎有一定的保护作用(见封三彩版图5)。

按照试验方法所述肠炎评级标准对各组试验仔猪肠炎发生情况进行评级,结果见图6。

通过肠炎评分结果可知,空肠HS 组与其余两组的差异主要体现在黏膜下层水肿,回肠HS 组与其余两组的差异主要体现在黏膜下层充血和中央乳糜管水肿两项。在空肠和回肠,HS 组与CN 组肠炎评分均存在显著差异,说明高豆粕大豆抗原可引起仔猪肠道炎症。比较HS 组与PL 组可知,回肠中两组间肠炎评级分数存在显著差异,说明添加紫苏叶可以缓解大豆抗原引起的回肠肠道炎症,而在空肠中,虽然PL 组与HS 组肠炎评级分数差异不显著,但其炎症程度低于HS 组,说明添加紫苏叶减轻肠道炎症的主要部位在回肠。

3 讨论

豆粕作为优质的植物蛋白源,广泛应用于仔猪的断奶饲粮,但是其中的大豆抗原蛋白是主要的致敏因子,会影响动物机体对营养成分的吸收,使得仔猪出现肠道炎症反应,导致仔猪免疫功能紊乱、肠道形态损伤、生长抑制以及腹泻,严重者可导致死亡等[10-11]。大豆抗原会诱发仔猪的过敏反应,主要是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型过敏反应[12],当大豆抗原被采食后,3 种过敏反应均会发生,而且Ⅰ型会促进Ⅲ型过敏反应的发生[13]。综合临床症状、肠炎标志物、肠道病理变化等结果,我们发现高大豆抗原可以明显引起仔猪的炎症,这与之前的结果是一致的[14]。

图6 仔猪肠炎评分

在试验期间,我们发现HS 组腹泻率显著高于CN 组,而PL 组与CN 组没有差异,说明豆粕中的大豆抗原可以引起仔猪腹泻,而添加紫苏叶一定程度上能减轻大豆抗原引起的腹泻。在第3、5、7 天,HS组MPO 水平显著高于CN 组和PL 组,说明HS 组存在炎症,需要借助嗜中性粒细胞来清除体内的炎症。α1AT 是动物血浆中最重要的蛋白酶抑制剂,能抑制多种丝氨酸内切肽酶,如嗜中性粒细胞弹性蛋白酶,其主要作用是保护机体正常细胞和器官不受蛋白酶的损伤,抑制感染和炎症,维持机体内环境的平衡,是抗炎症的急性期反应物。在第3,5 天,HS 组高于CN 组和PL 组,这与MPO 结果相似。

在空肠,HS 组表现出明显的上皮细胞坏死、炎性细胞浸润及黏膜下层水肿等病理变化,添加紫苏叶可以显著减缓黏膜下层水肿程度。在回肠,HS 组表现出明显的上皮细胞坏死、炎性细胞浸润、中央乳糜管水肿、黏膜下层水肿、黏膜充血和淋巴滤泡排空,添加紫苏叶可以显著减缓黏膜下层水肿程度、改善黏膜充血状况。肠炎评级结果显示,在空肠和回肠,HS 组与CN 组肠炎评分均存在显著差异,说明豆粕中的大豆抗原可以造成肠道炎症,回肠的肠炎(12.67)评分高于空肠(7.83),说明大豆抗原引起肠炎的主要作用部位发生在回肠。在回肠,PL 组肠炎评分与HS 组存在显著性差异,而空肠差异不显著,这说明添加紫苏叶起到的保护性作用主要发生在回肠。