补肾强身片质量标准提高研究

2019-08-20

中国民族民间医药 2019年13期

1.甘肃中医药大学药学院，甘肃兰州 730000；2.甘肃省药品检验研究院，甘肃兰州 730000；

补肾强身片具补肾强身之功，君药淫羊藿补肾壮阳，臣药狗脊补肝肾、强腰膝，菟丝子补阳益阴、固精缩尿、明目止泻，佐药女贞子滋肾明目，金樱子固精止遗[1-2]。原标准中有显微鉴别，化学反应及淫羊藿TLC鉴别，未见含量检测；相关文献[3-7]多数只有淫羊藿TLC鉴别和单一成分的含量测定；个别文献[8-10]对该成药中的化学成分做了定性分析，并对其中6种化学成分进行了定量分析。经验证，原标准中淫羊藿TLC鉴别专属性差，不能很好地重现，故改进淫羊藿鉴别方法，同时新增菟丝子、金樱子、女贞子的TLC鉴别，使其定性更准确。其次，本研究选淫羊藿苷为替代对照品[11-12]同时测定处方中5个指标成分的含量，以期在多组分含量测定过程中减少对照品的使用，为补肾强身片标准的制定提供更强有力的依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器高效液相色谱仪：Waters 2998(美国Waters)；不同色谱柱：Agilent 5 TC、SunFire TM、Capcell pak均柱为C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱；恒温水浴锅(常州国华电器，HH-6)；十万分之一电子天平(MS205DU)、万分之一电子天平(ME204)均为瑞士梅特勒公司；超声波清洗器(昆山市超声波仪器，KQ-500DE)；薄层色谱成像仪(瑞士CAMAG，Visualizer 2)。

1.2 材料对照药材：淫羊藿(121032-200501)、菟丝子(121232-201102)、女贞子(121041-200703)、金樱子(121047-200302)及对照品：淫羊藿苷(110737-201516，94.2%)、金丝桃苷(111521-201205，93.3%)、原儿茶酸(110809-200604)、绿原酸(110753-201716，99.3%)、朝藿定C(111780-201804，92.6%)均购于中国食品药品检定研究院；硅胶G板(青岛海洋化工)；磷酸(分析纯)；实验水(超纯水)；甲醇、乙腈(进口色谱纯，99.9%)。补肾强身片(批号：1301、2301、3301、4301、5301、6301)及各药材阴性样品均由康县独一味生物制药有限公司提供。

2 方法和结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 淫羊藿TLC鉴别 ①样品溶液的制备：各批次样品约5 g，研细，25 mL乙醇水浴锅回流半小时，放至常温后过滤，蒸干滤液，加水35 mL少量多次溶解残渣，先用乙醚萃取两次(20 mL/次)去除色素，水层再用乙酸乙酯萃取两次(25 mL/次)，弃去水层，蒸干，2 mL乙醇溶解残渣，即得。②对照药材溶液的制备：取1 g淫羊藿，同①项下处理，即得；另取适量淫羊藿苷，制成1 mg/mL的对照品溶液。③阴性样品溶液的制备：取适量淫羊藿阴性粉末，同①项下处理，即得。吸取淫羊藿药材5 μL，各批次样品1 μL，淫羊藿苷3 μL，阴性样品1 μL，点于G板上，用乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶2∶1∶1)展开[13]，晾干后喷1%AlCl3试液，105℃烘干，紫外光下观看。TLC图显示，在和对照同一位置可见黄色斑点，阴性样品没有影响。如图1所示。

2.1.2 菟丝子的TLC鉴别 ①样品溶液制备：各批次样品约5 g，研细，置于三角瓶中，加40 mL甲醇回流半小时，放至常温后过滤，蒸干，加水35 mL少量多次将残渣全部溶解，三氯甲烷萃取2次(20 mL/次)，三氯甲烷液蒸干，用1 mL三氯甲烷-无水乙醇(2∶3)混合液溶解残渣，即得。②对照药材溶液制备：菟丝子1 g， 30 mL甲醇回流半小时，放至常温后过滤，滤液浓缩至1 mL，即得。③阴性样品溶液的制备：取适量菟丝子阴性粉末，同①项下处理，即得。吸取菟丝子药材4 μL，阴性溶液2 μL，各样品溶液4 μL，点于G板上，用三氯甲烷-甲醇(20∶0.5)展开，晾干后喷磷钼酸试液，110℃加热显色。TLC图中，在菟丝子对照的对应位置可看到同样的绿色斑点(白光)，阴性样品没有影响。如图2所示。

2.1.3 金樱子的TLC鉴别 ①样品溶液制备：各批次样品约5 g，研细，置于三角瓶中，40 mL乙醇超声半小时，滤过，蒸干，加水30 mL少量多次溶解残渣，乙酸乙酯萃取两次(25 mL/次)，弃去水液，蒸干， 2 mL甲醇溶解残渣，即得[13]。②对照药材溶液制备：取1 g金樱子，同①方式提取，即得。③阴性样品溶液的制备：取适量金樱子阴性粉末，同①项下处理，即得。吸取阴性溶液1 μL，金樱子药材1 μL，各样品溶液6 μL，点于硅胶G板上，用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶0.2∶0.2∶0.5)展开，紫外光下观察。TLC图中，在金樱子对照的对应位置可看到同样斑点，阴性样品无影响。如图3所示。

2.1.4 女贞子的TLC鉴别 ①样品溶液：取金樱子样品溶液。②对照药材溶液制备：取0.5 g女贞子，30 mL三氯甲烷超声半小时，滤过，三氯甲烷液蒸干，2 mL甲醇溶解残渣，即得[13]。③阴性样品溶液的制备：取适量女贞子阴性粉末，同“2.1.3”项下①处理，即得。吸取阴性溶液1 μL，各样品溶液6 μL，女贞子药材6 μL，点于G板上，用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(5∶5∶1∶1)展开，喷10%硫酸乙醇，110℃加热显色。TLC图中，在女贞子对照的对应位置可看到同样的红褐色斑点，阴性样品没有影响。如图4所示。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件流动相：乙腈(B)-0.5%磷酸(C)；梯度洗脱：0～8 min，6% B；8～15 min，6%～11% B；15～23 min，11%～18% B；23～27 min，18%～21% B；27～33 min，21%～27% B；33～47 min，27% B；47～48 min，27%～6% B；48～60 min，6% B；柱温：30℃；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；波长：270 nm。色谱图如图5所示。

2.2.2 对照溶液配制用称量舟分别精密称取原儿茶酸16.30 mg， 21.51 mg，金丝桃苷18.96 mg，朝藿定C 20.31 mg，淫羊藿苷20.27 mg分别用甲醇定容至50 mL。另精密吸取原儿茶酸1 mL、绿原酸1 mL、金丝桃苷1 mL、朝藿定C 5 mL、淫羊藿苷4 mL于25 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，得浓度分别为0.01304 mg/mL、0.017087544 mg/mL、0.014151744 mg/mL、0.07522824 mg/mL、0.061101888 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.3 样品溶液的制备各批次样品精密称量1.0 g，置于三角瓶中，每批两份平行样，精密加25 mL稀乙醇，称重，超声1 h，冷却后补足失重，混合均匀后静置，取续滤液。

2.2.4 专属性取混合对照溶液10 μL、样品溶液10 μL，按上述色谱条件进样测定，结果显示，在相应保留时间，样品和对照品相应位置检出色谱峰。如图5所示。

2.2.5 线性关系精密吸取5、7、9、10、11、13、15 μL混合对照品溶液进样测定。纵坐标(Y)为峰面积，横坐标(X)为进样量，得线性关系，见表1；各指标成分线性关系图，如图6～10所示。

表1 线性关系表

2.2.6 精密度精密吸取10 μL混合对照品溶液，连进6针，测得各成分平均峰面积：原儿茶酸298642(RSD=0.30%)、绿原酸165236(RSD=0.30%)、金丝桃苷290493(RSD=0.30%)、朝藿定C 1499789(RSD=0.40%)、淫羊藿苷1302262(RSD=2.80%)，说明精密度良好。

2.2.7 稳定性精密吸取10 μL样品(批号：3301)溶液分别在0、4、8、12 h进样测定，测得各成分峰面积RSD：原儿茶酸0.05%、绿原酸1.37%、金丝桃苷1.25%、朝藿定2.20%、淫羊藿苷2.69%，说明样品在12 h内稳定。

2.2.8 重复性根据“2.2.3”方法取样品(批号：3301)制备6份，按“2.2.1”项条件进样检测峰面积，计算峰面积RSD：原儿茶酸2.25%、绿原酸0.97%、金丝桃苷1.67%、朝藿定0.17%、淫羊藿苷2.87%，说明该方法可行。

2.2.9 加样回收率精密称取6份样品(批号：3301)各0.5 g，研细，参照《中国药典》2015年版四部9101指导原则[13]，根据各指标成分含量，设置高、中、低浓度对照品加入量，使其与待测成分量之比控制在1.5∶1，1∶1，0.5∶1，按“2.2.3”项处理，进样测定各指标成分峰面积并计算。结果见表2。

表2 回收率试验结果 (n=6)

续表2表2 回收率试验结果 (n=6)

2.2.10 相对校正因子的计算[11]以淫羊藿苷为内标物，计算淫羊藿苷相对于原儿茶酸、绿原酸、金丝桃苷、朝藿定C的校正因子，根据不同色谱柱测得的相对校正因子，得出综合校正因子，利用综合校正因子间接计算原儿茶酸、绿原酸、金丝桃苷、朝藿定C的含量，校正因子f值见表3。

2.2.11 含量测定按“2.2.1”项下条件，分别测定各批次补肾强身片样品，每个批次平行测定2次，计算含量；同时采用替代对照品法计算其余4个成分含量，结果见表4。

表3 校正因子f值

3 讨论

淫羊藿提取过程中增加了乙醚萃取步骤，研究发现在本试验中乙醚可有效去除淫羊藿药材的色素，薄层显色时使背景颜色降低，斑点更清晰可辨。金樱子和女贞子共用同一个样品提取液，调节展开剂比例即可将二者鉴别，简化了样品提取过程中的繁琐步骤，节约了时间。进行方法耐用性考察时，用不同厂家薄层板、不同温度、不同湿度分别对其进行展开，结果表明，不同板子、温度、湿度对TLC鉴别无太大影响，本研究方法可用于补肾强身片中各药材的定性鉴别。

按含量测定项下方法：①超声:20、30、40、50、60、70和80 min；②功率：100%、70%、50%；③溶剂：无水乙醇、50%乙醇、甲醇。结果功率100%+超声60 min+50%乙醇峰面积最大，因此选用该条件。相关文献[9]报道，特女贞苷为女贞子活性成分，本研究方法中特女贞苷不易检出，可能是梯度洗脱未能将特女贞苷分离出来，也可能是所选的提取溶剂和提取方法未将样品中的特女贞苷提取完全，故本文未曾列出特女贞苷含量测定。本试验曾尝试梯度洗脱的同时采用切换波长的方法采集各指标成分色谱峰，以期在各指标成分波长最大吸收处测定其含量，试验发现，切换波长会使样品基线发生漂移，不利于各指标成分含量测定，由于各指标成分在270 nm处均有紫外吸收，故最终选择单波长270 nm为其测定波长。

试验选择淫羊藿苷为替代对照品，利用相对校正因子同时测定5种成分含量；同时用不同色谱柱对校正因子进行考察，条件允许的情况下建议使用不同的仪器、色谱柱、柱温及检测波长对其进行进一步考察，使相对校正因子更加准确可靠。