合并甲状腺自身抗体阳性的肾小球疾病临床病理特征研究

宋佳治 熊祖应（通讯作者）

（1安徽医科大学北京大学深圳医院临床学院 广东 深圳 518035）

（2北京大学深圳医院肾内科 广东 深圳 518035）

文献报道，11%～40%的自身免疫性甲状腺疾病（AITD）患者可合并蛋白尿[1]。较多研究提示肾小球肾炎与AITD间存在相关性，如血清抗甲状腺自身抗体阳性组尿蛋白排泄率明显高于自身抗体阴性组（P＜0.05）[2]、女性肾小球肾炎患者自身免疫性甲状腺疾病患病率增加[3]等。更有研究者提出抗甲状腺球蛋白抗体（TG-Ab）[4-5]及抗甲状腺过氧化物酶抗体（TPO-Ab）直接沉积肾小球导致肾脏损害[6]，但多为个案报道，且也有相反的观点。本研究选取38例血清抗甲状腺自身抗体阳性的肾小球疾病患者，对其肾组织行免疫组化染色，以确定抗甲状腺自身抗体是否直接导致肾小球疾病。

1.资料与方法

1.1 一般资料

收集2015年1月—2018年11月在北京大学深圳医院肾内科行肾穿刺活检术诊断肾小球疾病患者资料，纳入满足以下条件者共38例设置为实验组（A组）：

（1）血清检测TPO-Ab升高（正常范围参考值小于等于4.9IU/ml）或TG-Ab升高（正常范围参考值小于等于9.0IU/ml）。（2）除外其他自身免疫性疾病、垂体疾病、肾上腺疾病、肿瘤等。

在2015年1月—2018年11月在北京大学深圳医院肾内科行肾穿刺活检术诊断肾小球疾病患者中，选取与A组性别、年龄及肾脏病理类型相似相当且除外甲状腺系统疾病者76例（按1:2比例）设置为对照组（B组）。

1.2 实验方法

仪器及实验试剂准备70℃烤箱、37℃恒温箱、PBS缓冲液、6.0pH柠檬酸抗原修复液、胃蛋白酶原抗原修复液、过氧化物酶抑制剂、抗甲状腺球蛋白抗体[EPR9730]ab156008（Abcam）、抗甲状腺过氧化物酶抗体[EPR5380]ab109383（Abcam）、山羊抗兔/鼠单克隆抗体（迈新）、DAB显色剂（迈新）、苏木素染色剂、二甲苯及梯度浓度酒精（无水乙醇、95%酒精、85酒精、75酒精）、PBS缓冲液、抗原稀释液。

实验步骤选取北京大学深圳医院甲乳外科近期行穿刺活检术桥本氏甲状腺炎及无甲状腺疾病患者各1名，病理科病理库调取相应石蜡标本，切片若干。按以下步骤进行实验：（1）烤片：石蜡切片70℃下烘烤2h；（2）脱蜡：将烘烤后的切片依次置于二甲苯及梯度酒精脱蜡、水化，PBS缓冲液洗3×5min；（3）抗原修复：柠檬酸热修复20min后冷却至室温/胃蛋白酶原修复18min，PBS缓冲液洗3*5min；（4）内源性过氧化物酶封闭（室温15min）；（5）参照说明书每张切片分别以1:100、1:250比例稀释后加入抗甲状腺球蛋白抗体/抗甲状腺过氧化物酶抗体，置于37℃恒温箱孵育2h/4℃冰箱下12～24h，取出放置至室温后，PBS缓冲液洗3*5min；（6）加入山羊抗兔单克隆抗体，37℃恒温箱孵育20min，取出放置至室温后PBS洗3×5min；（7）DAB显色30～60s，置于流动清水中15min洗净，苏木素复染30～40s，再次置于流动清水中15min洗净；（8）脱水干燥：梯度酒精至二甲苯脱水，封片。

选取所纳入实验组38例患者，自北京大学深圳医院病理科标本库调取相应肾脏病理石蜡切片，参照预实验步骤进行实验。

1.3 观察指标

观察分析A组年龄、性别、甲状腺功能及肾脏病理学特点。

自北京大学深圳医院检验科调取患者住院期间检验结果资料，比较A组与B组患者之间24小时尿蛋白定量、血肌酐、血清白蛋白，以及血清IgG、IgM、IgA、补体C3、补体C4水平的差异（采用SPSS22.0进行统计学分析，计量资料采用t检验方法，记录均值、标准差、t值、P值，其中P＜0.05认为所得均数值差异有统计学意义）。

2.结果

2.1 免疫病理

预实验结果显示桥本甲状腺炎患者甲状腺滤泡上皮呈现DAB染色阳性，而周围甲状腺基质则呈现为阴性，对比无甲状腺疾病患者甲状腺滤泡上皮及甲状腺基质染色均为阴性（图A～C）。以A、B为阳性对照，C为阴性对照，参照预实验方法对A组38例患者甲状腺自身抗体肾组织免疫组化染色，结果均为阴性；予调整实验方法，提高步骤（5）中抗体浓度；将步骤（3）中抗原修复方式尝试更换为胃蛋白酶原修复18min；步骤（7）中DAB显色实验延长至10min。得到该组患者上述免疫组化结果仍均为阴性（图D～G）。B组中选取膜性肾病及IgA肾病患者各1例，以上述同样方法性进行免疫组化实验，结果同为阴性（图H～I）。合并抗甲状腺抗体阳性的多种肾小球疾病患者肾脏组织均未能发现抗甲状腺抗体蛋白沉积。

2.2 临床资料

A组38例患者中女性为主，年龄20～35岁为主；其中29例有甲功异常，分别为甲减及亚临床甲减者16例，甲亢及亚临床甲亢者13例（表1）。青年女性患肾小球疾病者，应注意监测甲状腺自身抗体及甲状腺功能水平，以便于相关疾病的早期发现与预防。

合并甲状腺自身抗体阳性的肾小球疾病主要为IgA肾病、狼疮性肾炎、膜性肾病和系膜增生性肾小球肾炎（表2）。A组与B组血清IgG水平有显著差异，A组血清IgG水平明显较高（P＜0.05）；其余24小时尿蛋白定量、血清白蛋白、血肌酐以及血清IgM、IgA、C3、C4指标，两组间比较无统计学差异（P＞0.05）（表3）。合并甲状腺自身抗体阳性的肾小球疾病患者血清IgG较高，其机制不明。

图 甲状腺组织免疫组化结果对照及合并甲状腺自身抗体阳性的各类肾小球疾病患者肾组织免疫组化染色结果

表1 38例患者的原发甲功表现及性别分布特点

表2 38例合并甲状腺自身抗体阳性的肾小球疾病患者肾活检病理类型统计

表3 两组患者临床指标比较（）

表3 两组患者临床指标比较（）

检验指标 实验组 对照组 t P 24h尿蛋白定量（g/24h）2.77±3.04 2.90±3.62 -0.179 0.858血清白蛋白（g/L） 30.78±9.36 32.61±8.60 -1.037 0.302血肌酐（μmol/L） 90.24±47.76 94.59±67.65 -0.354 0.724血清IgG（g/L） 14.65±9.43 9.71±3.67 3.036 0.004血清IgM（g/L） 1.39±0.64 1.19±0.63 1.555 0.123血清IgA（g/L） 2.75±1.20 2.30±1.16 1.915 0.058血清补体C3（g/L） 0.85±0.41 0.91±0.32 -0.779 0.438血清补体C4（g/L） 0.22±0.12 0.22±0.10 -0.365 0.716

3.讨论

众所周知，许多肾小球疾病的发生与自身免疫因素密切相关，近年来甲状腺自身抗体在肾小球疾病中的作用逐步受到研究者们的关注。20世纪70年代国外学者首先报道了1例桥本甲状腺炎并发膜性肾病患者[7]，此后国外陆续有AITD相关肾损害的病例报道，多报道其临床表现及病理特点，且主要病理类型为膜性肾病[8]。国内有学者对维普数字资源库1989—2011时期ATID相关肾病报道收集整理后发现，这类肾损害病理类型多为膜性肾病；其次为系膜增生性肾小球肾炎与局灶节段性硬化，其他病理类型少见[9]，此结果与国外文献报道相近[10]。本研究中38例甲状腺自身抗体阳性的肾小球疾病主要为IgA肾病、狼疮性肾炎、膜性肾病和系膜增生性肾小球肾炎，与文献报道结果相近。如果能证实AITD合并肾损害患者肾组织中存在甲状腺自身抗体相关的特异性免疫复合物，那么将可能从免疫病理机制方面解释AITD在肾损害致病过程中的作用。

现阶段针对AITD相关肾损害免疫病理机制的研究报道相对较少。国外曾有AITD相关肾损害的病例报道，这些患者体内不仅发现TG-Ab等抗体，而且在肾小球上发现这些抗体的存在[4]。国外有学者用免疫病理方法证实了肾小球内甲状腺球蛋白沉积，其沉积部位可在肾小球毛细血管基底膜，亦可在系膜区。1999年国内有学者报道1例桥本甲状腺炎患者肾小球毛细血管基底膜上有TG-Ab沉积，证实了TG-Ab作为内源性抗原，在免疫复合物介导的肾小球肾炎中可能发挥了重要作用[5]。而2009年日本报道1例膜性肾病患者，其肾组织免疫荧光发现，IgG颗粒沉积与甲状腺过氧化物酶（TPO）的肾小球颗粒染色相一致，而甲状腺球蛋白染色缺乏，说明了由TPO介导的免疫复合物沉积在该患者肾小球，并据此推测TPO在该例疾病发生过程中发挥了一定作用[6]。

这些关于AITD与肾损害相关性研究多为个案的免疫病理方面工作，是否具有普遍性尚存较大疑问。本研究旨在收集更多合并血清抗甲状腺自身抗体阳性的肾小球疾病患者，尽管在阳性对照组织中证实抗甲状腺抗体阳性存在，但在纳入的38例多种肾小球疾病患者肾脏组织中均未能发现抗甲状腺抗体蛋白沉积，因此不能提供抗甲状腺抗体导致肾小球疾病的证据。

同时本研究中对比了甲状腺自身抗体阳性和阴性的肾小球疾病患者尿蛋白与血肌酐等肾损害指标，发现仅有合并甲状腺自身抗体阳性的肾小球疾病患者血清IgG较高，其机制不明，其余指标间差异并无统计学意义。甲状腺自身抗体在肾损害的发生机制中的作用仍有待于更深入的研究。