HPLC法测定心痛颗粒中阿魏酸含量

2019-08-20陈文明廖建萍通讯作者欧阳荣范金茹王芳李珊肖望重黄莉

医药前沿 2019年20期

陈文明廖建萍（通讯作者）欧阳荣范金茹王芳李珊肖望重黄莉

（湖南中医药大学第一附属医院湖南长沙 410007）

心痛颗粒是根据湖南中医药大学第一附属医院范金茹教授多年临床经验总结而成的经验方发展而来，原使用剂型为汤剂，由柴胡、川芎、郁金、桃仁、蒲黄、瓜蒌皮、甘草等10味药组成，具有活血化瘀，行气止痛的功效。主要用于不稳定型心绞痛属气郁痰瘀互结证的治疗。前期研究结果表明该方在改善冠心病合并颈动脉斑块证属痰瘀互结气郁患者中医证候方面明显优于西药[1]；与常规治疗不稳定性心绞痛的西药合用在改善中医证候、缓解心绞痛、停减硝酸甘油使用及降低血清MMP-2浓度等方面均明显优于单用西药[2]。本研究拟建立心痛颗粒中阿魏酸的含量测定方法，用于制剂的质量控制，现将研究结果报道如下。

1.仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪；岛津AUX220型电子分析天平；SK5200H型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；DHG101型电热恒温鼓风干燥箱（北京中兴伟业仪器有限公司）。

1.2 试药

阿魏酸对照品（批号：181218），购自中国食品药品检定研究院；心痛颗粒由湖南中医药大学第一附属医院生产（批号：20181109、20181227、20190110）；甲醇为色谱醇，水为纯化水，其余均为分析纯。

2.方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XD3-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-1%醋酸溶液（30:70）；流速1ml/min；检测波长321nm；柱温25℃；进样量10μl。理论板数按阿魏酸峰计算应不低于4000。

2.2 实验溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备取心痛颗粒约2.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.2 阴性对照品溶液的制备取除川芎外的心痛颗粒其余处方量药材，按心痛颗粒制备工艺制备缺川芎药材的阴性对照样品，照“2.2.1”项下方法制备缺川芎药材的阴性对照品溶液。

2.2.3 对照品溶液的制备取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色容量瓶中，加70%甲醇制成每1ml约含20μg的溶液，作为对照品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 干扰实验按“2.1”项色谱条件，取“2.2”项下3种溶液各20μl，依次进样检测。结果显示，供试品溶液中其他成分未干扰测定。高效液相色谱图见图1～图3。

图1 阿魏酸对照品

图2 心痛颗粒供试品

图3：缺川芎药材阴性对照品

2.3.2 线性范围的考察精密吸取对照品溶液2、4、6、8、10μl，依次注入液相色谱仪，按“2.1”项色谱条件测定，以阿魏酸进样量（μg）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程为：Y=14.277，X=6.2134，r=0.9999（n=5）。结果表明，阿魏酸进样量在0.048～0.24μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.3 精密度实验精密吸取对照品溶液5μl，重复进样6次，测得阿魏酸峰面积值。结果峰面积的RSD为0.68%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性实验取心痛颗粒样品6份，按“2.2.1”项方法制备供试品溶液，按上述色谱条件分别测定阿魏酸的峰面积。结果峰面积的RSD为1.16%（n=6），表面该实验方法重复性良好。

2.3.5 稳定性实验精密吸取同一供试品溶液，分别在0，4，8，12，16，24h时进样测定阿魏酸的峰面积。结果峰面积的RSD为0.93%（n=6），表明心痛颗粒供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.3.6 加样回收实验取已知含量的同一批号心痛颗粒样品9份，平均分为3组，分别按样品中阿魏酸量的80%、100%、120%加入阿魏酸对照品溶液，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，并计算加样回收率，见表1。

表1 样品中阿魏酸加样回收率测定结果（n=9）

2.3.7 样品测定取3个批次的心痛颗粒样品，按“2.2.1”项方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定各批次心痛颗粒中阿魏酸含量，见表2。

表2 心痛颗粒中阿魏酸含量测定结果

考虑到心痛颗粒处方药材不同产地、不同批次间阿魏酸含量的差异，结合实验研究过程中测量误差，参照文献报道[11-12]中有关阿魏酸含量的限度要求，拟确定心痛颗粒中阿魏酸的含量限度设定为不少于0.18mg·g-1。

3.讨论

3.1 检测波长的选择

采用紫外分光光度法，将阿魏酸在200～400nm波长范围内进行扫描，结果在321nm波长处有最大吸收，与《中国药典》2015版一部“川芎”项下的检测波长一致，同时供试品测定时在该波长处无干扰。因此，检测时选择321nm作为检测波长。

3.2 流动相的选择

根据药典及文献资料报道[3-9]，阿魏酸用HPLC法测定含量，选用的流动相有乙腈-0.1%冰醋酸、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.2%磷酸、甲醇-1%醋酸等，前期实验中，对以上流动相均进行了考察比较，结果采用甲醇-1%醋酸（30:70）为流动相，色谱峰基线平稳，分离度良好，理论板数符合要求。

3.3 含量测定指标的选定

一般来说，制剂的质量控制主要是对主药有效成分的含量进行测定。根据心痛颗粒的组方原则，以疏肝豁痰化瘀法立方，方中柴胡疏肝解郁，瓜蒌清热化痰、宽胸散结，川芎活血祛瘀、行气止痛，又善能调肝，同为君药。川芎中主含苯肽类、酚酸、生物碱等多种成分，其中酚酸类成分阿魏酸具有改善血液流动性、抑制血小板聚集、预防血栓形成等药理作用[10]，其与心痛方主治病证气郁痰瘀互结型不稳定型心绞痛相吻合。因此选用阿魏酸含量作为该制剂质量控制的主要测定指标。