高迁移率族蛋白1在骨肉瘤的表达及意义

钟志辉　白国昌

[摘要] 目的 探讨高迁移率族蛋白1（HMGB1）在骨肉瘤组织的表达情况及其与临床病理因素之间的关系，并探讨可能机制。 方法 方便选取2012年1月—2016年12月53例确诊为原发性骨肉瘤患者作为实验组，同期确诊为骨软骨瘤30例患者作为对照组，采用免疫组化检测HMGB1蛋白的表达情况。在实验组分析HMGB1的表达与临床病理因素之间的关系，并探讨其与Ki-67的表达关系。 结果 骨肉瘤组织中HMGB1蛋白表达于细胞核和细胞质中，有54.7%病例为高表达，其比率高于骨软骨瘤病例（23.3%），差异有统计学意义（P=0.006）。HMGB1的高表达与较高级的Enneking分期（P=0.011）和远处转移（P=0.003）有关。相比之下，HMGB1的表达与其他临床因素（包括性别、年龄、解剖位置、原发肿瘤大小和组织学类型）之间没有显著相关性（P>0.05）。并且HMGB1蛋白的表达与Ki-67蛋白表达之间呈正相关关系（γ=0.632，P<0.05）。 结论 HMGB1在骨肉瘤发生发展中具有重要作用，有望成为骨肉瘤诊断及治疗的分子靶点。

[关键词] 骨肉瘤;HMGB1; Ki-67;免疫组化

[中图分类号] R684          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-0742（2019）05（a）-0001-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of high mobility group protein 1 （HMGB1） in osteosarcoma and its relationship with clinicopathological factors and possible mechanism. Methods From January 2012 to December 2016， a total of 53 patients with primary osteosarcoma were convenient selected as the experimental group while 30 patients with osteochondroma were selected as the control group. The expression of HMGB1 protein was detected by immunohistochemistry. In the experimental group， the relationship between HMGB1 expression and clinicopathological factors was analyzed. Moreover， the relationship between HMGB1 expression and Ki-67 expression was also explored. Results Expression of HMGB1 protein was detected both in the nucleus and cytoplasm of osteosarcoma cell. The expression of HMGB1 in osteosarcoma was higher than that in osteochondroma （54.7% vs 23.3%， P=0.006）. The high expression of HMGB1 was associated with the high Enneking stage （P=0.011） and distant metastasis （P=0.003）. In contrast， there was no significant correlation between HMGB1 expression and other clinicopathological factors， including gender， age， anatomical location， size of primary tumors and histological type （P>0.05）. The expression of HMGB1 protein was positively correlated with the expression of Ki-67 protein （γ= 0.632， P<0.05）. Conclusion HMGB1 plays an important role in the occurrence and development of osteosarcoma and is expected to become a molecular target for diagnosis and treatment of osteosarcoma.

[Key words] Osteosarcoma; HMGB1; Ki-67; Immunohistochemistry

骨肉瘤作为最常见的恶性、原发性骨肿瘤之一，是儿童和青少年癌症相关死亡的第二原因[1]。它被认为是起源于与骨形成相关的原始间充质细胞，通常位于长骨干骺端，尤其是胫骨近端和股骨远端[2]。尽管新辅助化疗和手术切除技术有了很大改进，骨肉瘤的总生存率在过去几十年中没有显著变化。更糟的是，有局部复发和远处转移患者的5年生存率低于30%[3]。虽然一些基因的突變被认为与骨肉瘤有关，但其发病的分子机制仍不清楚[4]。因此，寻找新的诊断和预后标志物，寻找潜在的治疗靶点，对提高骨肉瘤患者的预后具有重要意义。

高迁移率族蛋白-l （High-mobility group protein B1，HMGB1） 是一种广泛存在于真核生物的非组蛋白染色体结合蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中具有很高的迁移率而得名[5]。新近研究发现HMGBl在多种类型肿瘤的表达水平均显著高于相应的正常组织，如乳腺癌、前列腺癌、胃肠道腺癌、肝细胞癌、结直肠癌、宫颈癌等，且大多与临床预后相关[6-8]。但HMGB1与骨肉瘤的关系相关研究仍鲜有报道。因此，该研究方便选取2012年1月—2016年12月53例原发性骨肉瘤患者，检测骨肉瘤组织中HMGB1的表达，并探讨HMGB1的表达与临床病理因素的关系及可能的机制，现报道如下。

1  资料与方法

1.1  一般资料

方便选取福建医科大学第一附属医院和漳州市医院骨科53例原发性骨肉瘤患者。所有骨肉瘤均未经任何处理收集。将初始活检组织标本冻存于液氮中直至使用。在确诊后，所有患者根据Enneking分期系统进行术前新辅助化疗和手术切除[9]。出院后定期随访。从医院病历中获取肿瘤部位、局部、远处状态和总生存率等相关临床资料。选取同期确诊为骨软骨瘤30例患者作为对照。该研究经医院伦理委员会批准，且所有入选患者均签署知情同意书。

1.2  主要实验试剂

HMGB1单克隆抗体、Ki67 单克隆抗体抗体购自美国Abcam公司。抗原修复液、PV-9000试剂及二氨基联苯（DAB）显色试剂盒等购自福州迈新生物技术有限公司。

1.3  免疫组化方法

骨肉瘤及骨软骨瘤组织以蜡块形式储存，实验时取出，切成4μm厚切片贴附于载玻片，置60℃烤箱中过夜。依次置于二甲苯、无水酒精中、95%酒精中、80%酒精、70%酒精中进行脱蜡和再水合。使用柠檬酸盐缓冲液（10 mM，pH 6）在微波炉中进行热诱导抗原回收。使用正常山羊血清抑制内源性过氧化物酶的活性，再将载玻片与3%过氧化氢溶液在甲醇中孵育。随即在切片上加入抗HMGB1（Abcam，美国）或Ki-67（Abcam，美国）小鼠单克隆抗体，在4℃孵育过夜。然后用过氧化物酶抗小鼠血清免疫球蛋白G（ZSGB-BIO，中国）孵育切片。洗涤后，用DAB显色试剂盒检测HMGB1。再用苏木精对细胞核进行复染色。最后，在一系列的酒精稀释和二甲苯中脱水切片。

1.4  观察指标

为了评价目标蛋白的染色结果，每张切片均由2名病理科医生独立双盲观察。随机选取具有代表性的10个高倍视野，每个视野计数约200个细胞。根据染色细胞百分率和染色强度进行评分。染色细胞百分率分级评分：染色细胞<5%为0分， 6%～25%为1分，26%～ 50%为2分，>51%为3分;染色强度分级评分：基本不着色为0分，浅着色为1分，适中着色为2分，深着色为3分。将每张切片染色细胞百分率得分与染色强度得分相加为最终得分：0～3分为低表达，超过3分为高表达。

1.5  统计方法

所有数据使用SPSS 22.0统计学软件进行分析。计量数据用均数±标准差（x±s）来表示，计量资料比较用t检验，计数资料[n（%）]用χ2检验，两种蛋白表达的相关性采用Spearman 相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  HMGB1在骨肉瘤及骨软骨瘤组织中的表达

为评估HMGB1在骨肉瘤中的表达，对53例骨肉瘤组织进行免疫组织化学染色。结果显示骨肉瘤组有29个样本（54.7%）中检测到HMGB1高表达，细胞核及细胞质中均可见。而在骨软骨瘤组30个样本仅有7样本（23.3%）检测到HMGB1高表达，两者差异有统计学意义，见表1。

2.2  HMGB1表达与骨肉瘤临床病理因素的关系

为探讨HMGB1表达与骨肉瘤临床病理特征的关系，将53例原发性骨肉瘤患者分为两组。结果显示HMGB1的高表达与较高级的Enneking分期（P=0.011）、和远处转移有关（P=0.003）。相比之下，HMGB1的表达与其他临床因素（包括性别、年龄、解剖位置、原发肿瘤大小和组织学类型）之间没有显著相关性，见表2。

2.3  HMGB1表达与Ki-67的相关性

HMGB1 蛋白高表达的病例中， Ki-67蛋白高表达率为75.9% （22/29）， HMGB1 低表达的病例中， Ki-67的高表达率为12.5% （3/24）。结果表明HMGB1蛋白的表达与Ki-67蛋白表达之间呈正相关关系（γ=0.632，P=0.002），见表3。

3  討论

骨肉瘤是严重威胁青少年健康的一种恶性肿瘤。尽管近年来新辅助化疗和切除重建方面有了明显的进展，但骨肉瘤总的生存率没有实质性的改变。因此，寻找能够准确的诊断和预后的分子标志物，从而进行骨肉瘤的精准治疗，以改善治疗效果显得尤为重要[10]。

该研究初步进行了HMGB1在骨肉瘤中的表达及与临床病理特征的关系研究。免疫组化的结果表明，HMGB1蛋白在超过一半的骨肉瘤患者组织中高表达，而骨软骨瘤这一良性骨病变组织中仅有23.3%的高表达率，两者差异有统计学意义（P=0.006）。He等人[11]研究也发现骨肉瘤细胞HMGB1高表达率达51.7%，与该研究接近。这提示HMGB1可能是骨肉瘤诊断的重要分子。近年来，Wu等[12]发现90例肺癌组织HMGB1高表达例数为51例（56.7%），而在临近正常组织中仅有30.0%高表达;Rrapaj等[13]发现HMGB1在恶性胸膜间皮瘤中也高表达。Kostova 等[14]研究发现，HMGB1在食管癌和结肠癌等多种恶性肿瘤细胞中表达率增高，并且在中度分化的癌中HMGB1蛋白的定位是细胞核周围的，而在低分化的癌中有非特异性核聚集的趋势。这与该研究结果相近，即HMGB1蛋白可同时表达于细胞核和细胞质中。大量研究表明HMGB1在许多恶性肿瘤组织中有不同程度的高表达提示HMGB1可能参与多种肿瘤的发生与发展进程。

進一步行临床病理因素与HMGB1相互关系研究，结果表明HMGB1表达增加与重要的临床病理因素有关，包括Enneking分期（P=0.011）、和远处转移（P=0.003）。尽管这两种因素通常与骨肉瘤较差的预后有关。但临床病理因素是病人就诊时不能改变的事实，其只能帮助判断而不是改变预后。然而，HMGB1与不良的临床病理因素相关，则提示其有可能成为潜在治疗靶点，有助于开发新药以改善骨肉瘤患者预后。尽管该研究提示HMGB1与原发骨肉瘤大小无关，但有研究提示HMGB1与肿瘤大小和核分级相关，并且HMGB1高表达直接导致骨肉瘤生存率下降[11]。这种差异一方面可能归因于所采纳的标准不一样，有的研究以肿瘤直径7 cm来分组，而该研究则以常用的5 cm来分组;另一方面可能是纳入的病例数存在抽样误差。此外，有研究提示HMGB1却可能是某些恶性肿瘤，如胰腺癌进展的抑制因素，因为HMGB1能抑制K-Ras基因驱动的肿瘤进程[15]。这表明HMGB1所发挥的作用可能与肿瘤类型相关。

HMGB1影响恶性肿瘤的进展机制目前尚未被完全阐明。Ki-67是一种细胞核蛋白，除静止期以外的所有细胞周期中均有表达，故其被当做大多肿瘤组织细胞增殖活性的标记物。许多研究提示 Ki-67 的表达与骨肉瘤的恶性程度及预后等因素密切相关。该研究发现53例骨肉瘤患者中有25例Ki-67高表达，且其中22例一并有HMGB1高表达，两者之间呈明显的正相关，相关系数达0.632，提示HMGB1可能通过促进骨肉瘤细胞的增殖来促进肿瘤的进展，因此与不良的临床病理因素关联。有学者则认为HMGB1通过增加肿瘤相关的转录因子或增加血管形成来促进恶性肿瘤的进展[16];或者HMGB1通过促进上皮间质转化来促进前列腺癌的进展[8];也有研究表明HMGB1与乳腺癌细胞的干细胞特性相关[17]。该课题组前期实验证实Ki-67与骨肉瘤干细胞标志物CD133表达正相关，而且两者结合更能判定其预后[18]。那么HMGB1与骨肉瘤的干细胞特性是否相关值得进一步研究。此外，HMGB1影响骨肉瘤进展的其它机制仍尚不完全清楚，需要进一步研究。该研究还有其他局限性，如该研究属于回顾性研究可能会导致信息收集的偏倚，样本量不够大。因此，将在未来进行更大规模和更具前瞻性的研究。

综上所述，该研究初步表明HMGB1的高表达与骨肉瘤的侵袭性临床病理特征相关。因此，HMGB1在骨肉瘤发生发展中具有重要作用，有望成为骨肉瘤潜在的诊断与预后生物标志物，以及有前途的骨肉瘤分子治疗靶点。

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（收稿日期：2019-01-29）