Marc-145细胞为载体培养条件优化研究

赵 刚 闫 冰 刘鑫莹

(哈药集团生物疫苗有限公司,黑龙江哈尔滨 150069)

目前国内Marc-145细胞培养均采用转瓶生产工艺，由于受到转瓶表面积和培养条件的限制，生产细胞密度低，劳动强度大，操作过程易污染，疫苗质量难以得到保证。自从60年代微载体生物反应器培养技术建立以来，国外许多国家对其在疫苗生产中的应用进行了广泛研究，本研究采用Marc-145细胞微载体培养，并对培养过程中的各项技术条件进行优化，从而总结出一套较为合理的生产工艺，为Marc-145细胞的大规模培养提供可靠的参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株与微载体 Marc-145细胞（购自中国兽医药品监察所），微载体 Cytodex1（购自美国GE公司）。

1.1.2 试剂与仪器 新生牛血清（济南劲牛生物科技有限公司）；0.25%胰酶（美国Gicbo公司）；MEM培养基（美国Gibco公司）；结晶紫细胞裂解液有哈药集团生物疫苗有限公司研发中心配制；立式压力蒸汽灭菌锅（上海博讯有限公司）；二氧化碳培养箱（美国Thermo Fisher，参数设置：37℃，5% CO2）；细胞培养磁力搅拌器（美国Wheaton）；倒置相差显微镜（日本OLYMPUS）。

1.2 方法

1.2.1 Marc-145细胞复苏培养

将细胞冻存管自液氮罐中取出，置37 ℃水浴，使管内冻存液迅速融化。常温1000 r/min，离心5 min。弃去上清，用少量细胞生长液将细胞重悬后移入细胞培养瓶中，加入10 ml细胞生长液，于37 ℃、5 % CO2培养箱中静置培养。待细胞长成单层后，用胰酶消化液消化，并按1：3的比率进行扩增培养。

1.2.2 微载体预处理

称取所需质量的微载体Cytodex-1，按100 ml：1 g的比例用PBS浸泡微载体，轻微搅拌使微载体均匀浸泡3 h，121 ℃、灭菌30 min；倒掉PBS，以30 ml：1 g的比例用培养基将微载体洗涤2次，将微载体放置在4 ℃冰箱内平衡过夜，待用。

1.2.3 微载体细胞计数

取1 ml含微载体的培养液，900 r/min离心5 min，后弃掉上清，加入与上清相同体积的0.1%结晶紫溶液，混匀后于37 ℃中孵育1 h，然后用血球计数板计数释放出来的细胞核，即为1ml培养液中的细胞数。

1.2.4 微载体培养Marc-145细胞试验条件的优化

（1）搅拌转速的确定

以微载体Cytodex-1用量为2 g/L、细胞接种密度为2×105cells/mL，加入细胞生长液后分别设定转速为30、40和50 rpm培养细胞，每天取样，观察微载体上细胞吸附和生长情况，并采用结晶紫方法计数，确定出合适的搅拌速度。

（2）Marc-145细胞接种密度的确定

微载体Cytodex-1用量为2 g/L，分别以0.5×105、1.0×105、2.0×105和4.0×105cells/mL密度接种细胞。每天取样，观察微载体上细胞吸附和生长情况，并采用结晶紫方法计数，确定出合适的接种密度。

（3）微载体含量的确定

按照确定的接种密度2.0×105cells/mL与微载体用量2 g/L的比例关系，即在cells/g微载体相同的条件下接种Marc-145细胞，考察Cytodex-1含量分别为1 g/L、2 g/L、4 g/L微载体上细胞吸附和生长情况，并采用结晶紫方法细胞计数，确定出合适的微载体含量。

2 结果

2.1 Marc-145细胞培养

Marc-145细胞于传代后3 d即可长成致密单层（图1），在显微镜下可以观察到，细胞形态良好，透光性好，界限清晰。

图1 Marc-145细胞

2.2 搅拌转速的确定

当转速分别为30、40、50 rpm时培养细胞，细胞生长情况如图2所示。从图中可以看出，在培养过程中随着搅拌速度的增加，细胞最大生长密度先升高后降低，当搅拌速度为40 rpm时，细胞密度最大为1.4×106cells/mL，培养效果最理想。因此本试验搅拌速度采用40 rpm。

图2 不同搅拌速度细胞生长曲线

2.3 细胞接种密度的影响

当微载体Cytodex-1用量为2 g/L，以0.5×105、1.0×105、2.0×105和4.0×105cells/mL密度接种细胞。每天取样分析，细胞生长动力学过程如图3所示。

从图3可以看出，当微载体含量相等，接种密度不同时，细胞生长趋势与文献报道相似[75]。以0.5×105、1.0×105cells/mL接种时，接种密度低时，接种后84 h内仍在缓慢生长，没有进入稳定生长期的明显标志，而且细胞密度也比较低；而以2.0×105和4.0×105cells/mL接种细胞时，接种密度高，细胞在接种后60 h即开始进入稳定生长期，细胞密度较高都在1.4×106cells/mL以上。因此综合考虑，本试验选择细胞的接种密度是2.0×105cells/mL。

图3 不同接种密度Marc-145细胞生长曲线

2.4 微载体含量的确定

在微载体浓度为1 g/L、2 g/L、4 g/L的不同试验条件下，每天分别从培养瓶中取样并进行细胞计数，结果显示当培养瓶中微载体的浓度为4 g/L时，培养到72 h时细胞密度最大为1.8×106cells/mL，培养效果最理想。细胞计数的结果如图4所示，因此本试验微载体含量采用4 g/L。

图4 不同Cytodex-1浓度对Marc-145细胞生长曲线

3 讨论

本研究通过设置不同搅拌转速、细胞接种密度和微载体含量3个条件，研究了不同培养条件对Marc-145细胞生长的影响。

适当的搅拌速度对于微载体悬浮培养是非常重要的，若搅拌转速过低，微载体有沉降的趋势，细胞不仅不能均匀生长，而且会发生结团。若转速提高，会促进营养物质的传递和供氧，有利于细胞的生长。但当转速过高时，虽然细胞与微载体的接触机率会相应的提高，但剪切力增加，对细胞的损伤也随之增加，同时微载体间连接的细胞桥也会断裂，细胞被拉长，裂解死亡。

当微载体含量相等时，以不同密度接种细胞，每个载体颗粒上开始的细胞数量不相同，细胞接种密度高时，每个微载体上的细胞数量增加，细胞在载体上分布比较均匀，细胞生长的空间大，不会或很少受到生长面积的限制，而且细胞消耗的营养物质和代谢产物的积累也相应降低，因此，细胞表现出较高的平均比生长速率。但细胞接种密度也不应过高，过高时由于受到生长面积的限制，细胞的扩展受到影响，使得平均比生长速率降低，同时降低了载体利用率。

本试验比较了在不同微载体浓度Marc-145细胞的增殖状况，摸索出了培养Marc-145细胞时最合适的微载体加入量，认为当加入的微载体颗粒浓度为4 mg/mL时，接种Marc-145细胞后是最有利于细胞增殖的，此时收获的Marc-145细胞数量最多。另外，微载体浓度过高时，在悬浮培养的过程中颗粒之间相互碰撞的机率就会大大增加，造成微载体颗粒破碎和细胞脱落；另一方面，高含量载体培养时，在搅拌时，载体间碰撞几率增加，会增加碰撞损伤细胞的机会，这也不利于细胞培养，而且，细胞的生长状况如果不好，也会影响到接下来的病毒增殖过程。因此本试验选择的微载体浓度最高为4 g/L。

4 结论

搅拌转速、细胞接种密度和微载体含量都会对Marc-145细胞增殖造成一定的影响，只有细胞生长条件适宜，才会最大程度的使细胞增殖，并达到预期效果，既设定搅拌速度为40 rpm、细胞接种密度为4.0×105cells/ml、微载体含量为4 g/L，培养72 h时，微载体上细胞汇合度大于90%，细胞密度最大为2.0×106cells/ml。