NK、Th17和Treg细胞水平对结直肠癌患者术后复发预测价值的分析

张 帆，邸泰霖，韩克松

结直肠癌（co lorectal carcinoma，CRC）是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，近年来我国的患病率和病死率都呈明显的上升趋势[1]，据2012年肿瘤登记年报报道，其发病率已跃居恶性肿瘤的第3位，死亡率排第5位，在北京、上海等大城市发病率更高[2]，由其生存率较低，严重威胁人民身心健康。因此对于结直肠癌的治疗成为临床研究的热点问题之一。但调查显示，其复发率与常规开腹手术近似[3]，因此如何早期预测、降低腹腔镜根治术的术后复发率，延长患者的生存时间成为临床迫切解决的问题。有项研究表明[4]结直肠癌术后的复发与患者体内的免疫细胞如NK、Th17和效应T调节性（Treg）等水平有一定程度的关联，而国内有关报道较少。本研究拟探讨NK、Th17和Treg免疫细胞水平对经腹腔镜根治术治疗后结直肠癌患者复发的影响，从而采取有效的预防措施，对提高腹腔镜结直肠癌根治术临床治疗效果，延长患者的生存时间具有重要的临床价值和社会意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1月—2017年1月于中国石油天然气集团公司中心医院普通外科收治的结直肠癌患者120 例（结肠癌78例，直肠癌42例）作为研究对象，所有结直肠癌患者均行腹腔镜根治术进行治疗。其中男性75例，女性45例，年龄19～63岁，平均（ 54.6± 13.1） 岁，体重 51～79 kg，平均体重（60.4 ± 4.9） kg。

纳入标准：（1）临床相关资料完整；（2）术前均行纤维结肠镜及活检病理检查确诊为结直肠癌；（3）术前均无肠梗阻、周围邻近或远处脏器肿瘤侵及（经肺部X片、术前上腹部彩超及腹部CT证实）；（4）术后能够被随访者；（5）术后均采集外周血测定免疫功能。

排除标准：（1）急诊手术患者；（2）既往有腹部大手术史考虑存在严重腹腔粘连者；（3）一般情况差或合并其它疾病不适合手术治疗的患者；（4）姑息性切除手术患者；（5）急性感染、慢性炎症性疾病患者；（6）术前行放化疗者；（7）术后未能完成随访；（8）病例资料不完整。

所有研究对象均自愿参加本次研究，并签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 试剂与方法

1.2.1 试剂和仪器 鼠抗人 CD4-PC5、CD25-FITC、CD127-PE单克隆抗体（美国Becton Dickinson公司）、同型对照IgG1-PC5、IgG1-FITC、IgG1-PE和红细胞裂解液（美国Becton Dickinson公司）；FACSCalibur细胞流式仪（美国BD公司）。

1.2.2 方法 免疫相关细胞检测：（1）所有研究对象行腹腔镜根治术后第一天采集晨起空腹肘静脉血5 mL，经EDTA-2K抗凝。（2）采用流式专用试管，加入CD4-PC5、CD25-FITC、CD127-PE抗体及同型对照各20 μL，振荡混匀后，在室温下避光孵育30 min；（3）加入溶血素1 mL，在室温下避光孵育10 min；（4）加PBS 1 mL，振荡混匀；（5）将流式专用试管放入高速离心机中，并以2000 r/min，离心 5 min；（6）弃上清，PBS 重复洗涤两次；（7）取1 mL PBS 悬液上机：采用流式细胞仪进行分析，采用 Cell Quest软件进行上样，检测NK、Thl7和Treg细胞含量。

1.3 随访 从2016年1月第一例患者术后出院开始，对纳入本次研究的所有患者进行随访，计划随访3年。术后1年内每隔3个月对患者进行一次门诊复诊。此后根据患者情况每年至少行血生化及CT检查1次。如患者确诊复发[局部复发（包括吻合口复发、盆腔复发及会阴部复发等）、远处转移复发（包括肝转移、肾转移、肺转移、骨转移及腹腔内广泛转移等）]，再次行腹腔镜根治术进行治疗。

1.4 观察指标 根据患者术后有无复发分为复发组与非复发组，观察两组患者的一般资料（年龄、性别、BMI等）、肿瘤直径，原发灶部位、原发灶分期、术前CEA浓度、术前CA19-9浓度；术前及术后NK、Th17和Treg免疫细胞水平以及是否进行化疗。

1.5 统计学处理 采用SAS9.4统计软件进行数据分析，计量资料以（）表示，两组间差异采用两独立样本t检验。计数资料以例数（%）表示，组间差异采用χ2检验。先进行单因素分析，初步筛选出术后复发的影响因素，再进行多因素Logistic回归分析，筛选出独立影响因素。采用ROC曲线分析NK、Thl7和Treg细胞水平预测结直肠癌术腹腔镜根治术后复发的价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较 共纳入120例患者，结果发现复发患者24例，未复发者96例。临床资料特征参数在两组患者间的差异均无统计学意义（P＞0.05），见表 1。

表1 两组患者治疗前临床病理特征分析

2.2 两组患者术后免疫细胞比例的分布情况 两组患者术后复发组NK细胞、Th17细胞水平显著低于未复发组（P＜0.05），但Treg细胞水平复发组要高于未复发组（P＜0.05），见表2。

表2 两组NK、Thl7和Treg细胞水平比较

2.3 患者术后复发的多因素Logistic回归分析 为进一步了解以上因素与结直肠癌患者经腹腔镜根治术后复发的关系，控制混杂因素，以术后是否复发为因变量，将年龄、性别、BMI、NK细胞、Th17细胞和Treg细胞水平作为自变量纳入Logistic回归模型中，采用全变量法，变量进入水平0.05，剔除水平为0.10，进行多因素Logistic回归分析，结果显示：Treg细胞水平是影响结直肠癌术后复发的独立危险因素（OR=1.93≥1，P＜0.05），而NK细胞、Th17细胞是保护性因素（OR分别为 0.88、0.68，P＜0.05），见表 3。

表3 影响术后复发的多因素Logistic回归分析结果

2.4 NK、Th17和Treg细胞水平预测CRC术后复发效能分析 对多因素logistic回归分析有统计学意义的指标分别进行ROC曲线分析，将术后未复发组作为对照组，术后复发组作为病例组，进行指标的诊断效能分析，结果发现：NK、Thl7和Treg细胞的ROC曲线下面积差异有统计学意义（P＜0.05），AUC 分别为：0.697（0.541，0.853）、0.743（0.644，0.843） 和 0.797（0.713，0.880）。 当 NK 细 胞（%）=21.166时，诊断的灵敏度为0.542，特异度为0.927，阳性预测值为0.650，阴性预测值为0.890；当Th17细胞（%）=13.957时，诊断的灵敏度为0.792，特异度为0.708，阳性预测值为0.404，阴性预测值为0.932；当Treg细胞（%）=8.247时，诊断的灵敏度为0.958，特异度为0.552，阳性预测值为0.348，阴性预测值为0.981。可见Treg细胞水平无论曲线下面积还是灵敏度都高；NK细胞其预测复发的价值有限，但是其特异度较高；而Th17预测价值适中，鉴别诊断价值更高（表4、图 1）。

表4 NK、Thl7和Treg细胞对CRC复发预测效能分析

图1 NK、Thl7和Treg细胞的ROC曲线及对CRC复发预测效能分析

3 讨论

由于CRC是复发率及转移率均较高且预后较差的消化道恶性肿瘤，因此早发现、早诊断、早治疗对该病显得尤为重要。腹腔镜手术尽管属于一种微创手术，具有手术创伤小、手术视野清晰、患者术后疼痛小、利于恢复等优点，但患者术后复发率依然较高，因此能早期诊断、预测患者复发情况的指标在临床上尤其重要。目前临床上主要采用Dukes和TNM分期法来判断CRC的预后和临床治疗指导，由于微转移灶的存在，使其具有一定的局限性，如Dukes分期较早的结直肠癌患者术后却迅速出现转移或死亡等提示可能存在微转移[5]。近年来，随着肿瘤免疫学的兴起，研究肿瘤微环境中免疫细胞与肿瘤的发生、发生以及转移的报道逐渐增多，使得免疫细胞在肿瘤特别是结直肠癌的诊断、病情监测、疗效评价、预后评估等方面已成为一种不可或缺的手段[6-9]。

自然杀伤（NK）细胞是一群广泛分布于血液及外周淋巴器官中的重要先天效应细胞，可保护宿主抵御外来细菌、病毒、寄生虫的入侵及清除体内肿瘤细胞，起到天然免疫监视作用。故NK细胞活性是反映肿瘤患者的机体免疫功能状态常用指标，可以作为肿瘤疗效和预后判定的参考指标之一。因理论上认为当患者机体免疫功能低下时，休眠的肿瘤细胞可摆脱抑制状态而持续增殖，导致疾病进展，肿瘤复发和转移[10]。本研究经多因素logistic回归分析发现，OR=0.855＜1，NK水平是保护性因素，且复发组的NK细胞水平显著低于未复发组（P＜0.05），说明可能是由于患者术后调节免疫功能低下的原因，使得其复发组的NK水平降低从而导致其复发概率增加，这和冯国丽[10]研究结果一致。而ROC曲线分析提示NK细胞水平作为预测结直肠癌术后复发的标志具有一定的意义。

Th17细胞是近年来发现的一类新的CD4+T淋巴细胞亚群，其在活化状态下能高表达IL-17、TNF-α及IL-6而不表达IFN-γ，使其除具有促进炎症反应外，还参与机体的自身免疫以及肿瘤的免疫应答过程。尽管许多研究表明Th17细胞促进肿瘤的发生发展[11-13]，但也有研究表明Th17细胞能分泌的IL-17具有上调肿瘤组织中的CCL2、CCL20以及招募DC等免疫细胞到肿瘤局部组织而发挥抑瘤效应[14]。本研究经多因素logistic回归分析发现，OR=0.695＜1，说明Th17水平是保护性因素，且复发组的Th17细胞水平显著低于未复发组，说明随着结肠癌进展，进展期癌组织中Th17细胞逐渐降低，故复发组其Th17含量较低，ROC曲线分析表明Th17细胞水平可以作为结直肠癌术后预测复发的指标。

调节性T细胞（Treg）是一群通过抑制自身反应性T细胞而介导免疫耐受的负性调控细胞，约占人外周血中5%的CD4+T细胞。在维持机体自稳态、调控免疫应答方面起着重要的作用。其通过分泌TGF-β、IL-10及其他免疫抑制性细胞因子或分泌颗粒酶B和穿孔素直接抑制NK细胞的活化或杀伤效应T细胞，还可通过抑制APC的成熟或促进APC细胞分泌抑制性酶IDO间接诱导效应T细胞失能[15]，使得肿瘤细胞逃避免疫监视。多因素logistic回归分析发现，Treg细胞水平是术后CRC复发的独立危险因素（OR=1.857≥1，P=0.0053＜0.05），且术后复发CRC患者Treg细胞水平要高于未复发的CRC患者（P＜0.05），说明CRC患者外周血Treg细胞数量增高可能导致下调抗肿瘤免疫反应，促进肿瘤的免疫逃逸和疾病的进展，是患者预后差的一个信号，这和以往报道结果类似[16-18]。而ROC曲线分析表明Treg细胞水平可以作为结直肠癌术后预测复发的指标。

综上所述，结直肠癌患者术后的NK、Th17和Treg细胞水平与复发有关，是结直肠癌患者术后预后的独立危险因素，虽然其作为判断预后的指标，其真实性和准确性还有待考证，但对于其的研究或许可以成为肿瘤患者的预后诊断、检测、干预治疗的新思路。