多形性胶质母细胞瘤中RAD18的表达及与放射抵抗的关系

周亚燕 李子煌 李壮玲 方敏捷 李先明

【摘要】 目的 研究RAD18与多形性胶质母细胞瘤（GBM）放射抵抗的相关性。方法 80例放射治疗的多形性胶质母细胞瘤患者为研究对象， 根据是否复发分为观察组（复发）和对照组（原发）， 各40例。将人脑胶质瘤细胞系A172分别转染空白和装有RAD18的质粒载体， 应用克隆实验检测经相同剂量射线照射后两组细胞增殖情况， 采用定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）方法检测原发性及放射性粒子近距离治疗后复发性多形性胶质母细胞瘤样本中RAD18信使核糖核酸（mRNA）的表达情况， 并分析RAD18与多形性胶质母细胞瘤放射抵抗的相关性。结果 人脑胶质瘤細胞系A172中RAD18蛋白表达与正常人星形胶质细胞（NHAs）比较差异无统计学意义（P>0.05）。转染RAD18质粒的A172细胞中RAD18蛋白表达及γ射线照射后细胞克隆形成数量分别为（0.91±0.09）和（157.25±15.13）， 显著高于转染空白质粒的A172细胞的（0.22±0.02）和（55.24±5.31）， 差异具有统计学意义（P<0.05）。复发性多形性胶质母细胞瘤（观察组）的RAD18蛋白表达为（14.12±1.21）， 显著高于原发性多形性胶质母细胞瘤（对照组）的（7.18±0.71）， 差异具有统计学意义（P<0.05）。经直线相关分析， RAD18与多形性胶质母细胞瘤放射抵抗呈正相关（r=0.621， P<0.05）。结论 RAD18与多形性胶质母细胞瘤放射抵抗有关， RAD18的细胞修复能力会导致放射抵抗的发生， 临床在放射治疗时应针对RAD18进行抑制处理。

【关键词】 多形性胶质母细胞瘤;RAD18;放射抵抗;相关性

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.19.036

星形细胞肿瘤中恶性程度最高的是胶质母细胞瘤， 多见于成年人， 表现为毛细血管明显增生， 内皮细胞增生、肿大， 可导致管腔闭塞和血栓形成， 肿瘤发展迅速， 预后差， 患者多在2年内死亡[1， 2]。近年来， 随着医疗技术的不断提升， 其放射治疗水平也呈上升趋势， 精准度更强， 疗效更佳。但即使如此， 临床还是有相当一部分患者在治疗后出现复发， 对放射治疗出现抵抗， 临床已经证实其复发的原因与放射抵抗有关[3， 4]。因此本院展开研究， 探讨RAD18与多形性胶质母细胞瘤放射抵抗的相关性， 现将研究结果报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取2017年10月～2018年10月收治的80例放射治疗的多形性胶质母细胞瘤患者为研究对象， 患者均经临床诊断及检查确诊为多形性胶质母细胞瘤， 经影像学检查及手术证实是否复发， 患者均知情同意并排除不愿参加本次研究者及合并严重精神障碍者。患者根据是否复发分为观察组（复发）和对照组（原发）， 各40例。观察组男22例、女18例;年龄35～61岁， 平均年龄（48.82±4.61）岁;发病部位：额叶27例、顶枕叶12例、颞叶1例。对照组男19例、女21例;年龄36～62岁， 平均年龄（49.57±4.53）岁;发病部位：额叶26例、顶枕叶13例、颞叶1例。两组一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）， 具有可比性。

1. 2 方法 分别收集NHAs及胶质瘤细胞， 利用冰磷酸盐对其漂洗2次， 加入RIPA裂解液后于5 min冰上静置。展开超声破碎细胞， 吸入预冷的1.5 ml EP管中， 总共10～20次， 1～2 s/次， 5～10 s间隔后进行下一次。随后将其离心30 min， 转速选择最高。应用Bradford试剂盒对RAD18蛋白浓度展开检测。取等浓度蛋白样品置于碧云天生物技术研究所提供的12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶中电泳， 跑胶1.5 h， 分离胶部分90～100 V， 积层胶部分50～60 V。然后将胶转至聚偏二氟乙烯膜上。膜上加入1︰250稀释的鼠抗人RAD18一抗， 于室温下2 h孵育。随后对其进行15 min的洗膜， 总共3次。将经1︰1000稀释的羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗加入其中， 再次孵育， 与之前相比， 温度相同， 时间由原来2 h减至1 h， 洗膜次数一致。观察信号时使用增强化学发光免疫分析技术。参照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书， 对有抗性的细胞进行筛选。

将人脑胶质瘤细胞系A172分别转染空白和装有RAD18的质粒载体， 应用克隆实验检测经相同剂量射线照射后两组细胞增殖情况， 用Western blot检测两组RAD18变化。采用qRT-PCR方法检测原发性及放射性粒子近距离治疗后复发性GBM样本中RAD18 mRNA的表达情况， 分析RAD18与多形性胶质母细胞瘤放射抵抗的相关性。

1. 3 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验;计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验;RAD18与多形性胶质母细胞瘤放射抵抗采用相关分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

人脑胶质瘤细胞系A172中RAD18蛋白表达为（0.17±0.03）， 与NHAs的（0.18±0.02）比较差异无统计学意义（t=1.754， P>0.05）。转染RAD18质粒的A172细胞中RAD18蛋白表达及γ射线照射后细胞克隆形成数量分别为（0.91±0.09）和（157.25±15.13）， 显著高于转染空白质粒的A172细胞的（0.22±0.02）和（55.24±5.31）， 差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1。复发性多形性胶质母细胞瘤（观察组）的RAD18 mRNA表达为（14.12±1.21）， 显著高于原发性多形性胶质母细胞瘤（对照组）的（7.18±0.71）， 差异具有统计学意义（t=31.286， P<0.05）。经直线相关分析， RAD18与多形性胶质母细胞瘤放射抵抗呈正相关（r=0.621， P<0.05）。

3 讨论

RAD18参与多种蛋白酶的表达， 是一种泛素蛋白酶体系统的重要成分， 不仅能维护细胞正常活性， 还能对遗传物质稳定性起关键作用[2]。在放射治疗时， RAD18会因DNA损伤被招募至DNA损伤处， 利用RAD18对DNA双链断裂修复能力， 与泛素结合酶RAD6结合形成二聚体， 从而抑制细胞凋亡， 促使增殖细胞核抗原发生单泛素化， 在单泛素化后会向下游的效应器发出信号， 以此招募DNA聚合酶， 达到修复的目的。除此以外， RAD18不仅对跨损伤DNA合成有调节作用， 对氧化损伤也能起到修复作用。相关研究表明[3-5]， RAD18与多形性胶质母细胞瘤放射抵抗有关。本研究显示RAD18与多形性胶质母细胞瘤放射抵抗有关， RAD18的细胞修复能力会导致放射抵抗的发生， 与文献[6， 7]报道基本一致。复发性多形性胶质母细胞瘤的RAD18 mRNA表达量显著高于原发性， 其原因可能在于当患者细胞DNA受到放射治疗引起损伤后， RAD18会对损伤起到修复作用， 导致DNA的修复能力得到极大提升， 这也是实验结果显示RAD18升高的原因， 在此情况下， 能减少肿瘤细胞， 导致多形性胶质母细胞瘤患者产生放射抵抗， 因此， 证实了本次研究结果， 即RAD18与多形性胶质母细胞瘤放射抵抗存在相关性。根据此结果， 临床若以RAD18为靶点， 应用RNA干扰技术特异性抑制RAD18表达， 或许能够缓解多形性胶质母细胞瘤患者产生放射抵抗， 为放射治疗提高疗效。

综上所述， 放射治疗会导致DNA损伤， RAD18会修复此损伤， 引起患者放射抵抗， 临床在治疗时， 可采用RNA干扰技术， 专门针对RAD18进行抑制， 减少RAD18在放射过程中的作用， 提升治疗效果。

参考文献

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[4] 白璐， 王亮， 周凌然， 等. 腫瘤干细胞在食管癌放射线抵抗中的作用及分子机制研究. 中华放射肿瘤学杂志， 2016， 25（4）：401-406.

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[收稿日期：2019-02-11]