复方五凤草液对家兔结核性溃疡iNOS、Arg-1的影响*

黄子慧，余 洋，钱佳燕，朱思洵

(1.南京中医药大学附属南京市中西医结合医院，江苏 南京 210014；2.南京中医药大学，江苏 南京 210046)

结核性溃疡(Tuberculosis ulcer)是指结核分枝杆菌(MTB)[1]经各种传播路径侵犯机体局部组织，引起病灶周围软组织、皮下及皮肤的坏死，最终液化破溃而形成的创面，属于肺外结核，是世界上首要的感染性疾病[2]——结核病疫情的重要组成部分。表现为创面脓水淋漓，缠绵难愈，或假性愈合后反复发作，是临床常见的一种慢性难愈性创面。复方五凤草液为我院协定方，外用治疗结核性溃疡近20 a，临床疗效满意[3]。目前已知巨噬细胞在参与慢性创面修复的众多细胞中起到了总指挥的作用[4]，可塑性较强,不同的微环境可极化为M 1和M 2两种不同的类型[5]，其中M 1型主要参与炎症产生的起始和维持；M 2型主要参与组织修复。M 1向M 2型转换是创面由炎症反应转为修复性反应的关键[6]。而在结核性溃疡创面组织液化坏死高峰期时，M 1型数量明显多于M 2型[7]。本次实验，笔者构建结核性溃疡家兔模型,分别选择M 1、M 2型巨噬细胞的表型指标iNOS、Arg-1[8]进行观察，比较各模型家兔在药物干预过程中组织及血清中指标的变化，以此从巨噬细胞极化角度来探讨复方五凤草液有效促进结核性溃疡愈合的免疫机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SPF级雄性SD新西兰兔42只，体质量约200 g～220 g，平均(206.56±9.26)g，由南京青龙山动物繁殖场提供，动物许可证号：SCXK(苏)2012-0008。

1.1.2 实验药物

复方五凤草液处方：五凤草2 000 g白及240 g，猫爪草400 g等。制备工艺：将以上诸药，加水浸过药面，煎煮3次，每次1 h，合并煎液，滤过，滤液浓缩分装，生药含量为2.64 g/mL(此为高剂量组)。将该药液分别稀释2倍、5倍，制成中、低剂量组。以上药液由南京市中西医结合医院中药制剂室提供，用4 ℃冰箱保存；异烟肼针剂(天津金耀药业有限公司，批号H12020970)；亲水性纤维含银辅料[康维德(中国)医疗用品有限公司，批号7E04803]。

1.1.3 主要试剂

兔诱导型一氧化氮合成酶(型号：CSB-E08327Rb厂家：武汉华美生物工程有限公司，批号：N28036105)，L-精氨酸(型号：A137768厂家：上海阿拉丁生化科技股份有限公司),a-异亚硝基苯丙酮(型号：119-51-7；厂家：上海远慕生物科技有限公司)。

2 实验方法

2.1 动物分组及造模

将新西兰兔随机分为①空白组(普通溃疡组)；②模型组(结核性溃疡组)；③阳性药1组(异烟肼组)；④阳性药2组(亲水性纤维含银辅料组)；⑤复方五凤草液高剂量组；⑥复方五凤草液中剂量组；⑦复方五凤草液低剂量组。每组6只。

结核性溃疡模型制备：将冻存于-80 ℃BCG菌种(兰州大学结核病研究中心暨病原生物学研究所提供)取出，刮取菌落研磨，研磨后的菌体接种于7H9液体培养基进行培养增菌，菌落计数，确定菌液浓度，收集离心管沉淀细菌，新西兰兔在常规饲养1周后，腹腔注射盐酸氯胺酮(150 mg/kg体质量)麻醉，在造模区(两侧腹背部)剃毛，接种100 μL。6周后以相同剂量再次皮下注射免疫，大概免疫后4周，见皮肤病理改变(可见类上皮增生为主的结核肉芽肿，并可见朗罕氏细胞)。

2.2 换药方法

造模完成后换药，用75 %的酒精棉球消毒创周皮肤，先由创面周围开始,做圆圈状向心性擦拭,致创面边缘，以盐水棉球轻轻擦拭创面脓性分泌物。治疗组、异烟肼组以5 mL药液浸湿无菌棉片外敷创面、亲水性纤维含银辅料组根据创面的面积剪取适合辅料外敷创面、模型组予以普通油纱外敷、空白组建立全层皮肤缺损模型，予以普通油纱外敷。各组均外盖两层灭菌干纱布，胶布固定。隔日换药1次。

2.3 实验标本采集

造模成功后给药前以及给药后第3、7、14、21天分别采取创面相同部位肉芽组织及血清。将所采集标本放置-80 ℃冰箱。标本采集完全后，酶联免疫分析iNOS含量，Arg-1生化活性检测。

3 检测方法

3.1 酶联免疫分析iNOS含量

将原倍标准品在EP管中进行稀释400,200,100,50,25,12.5,6.252,0(U/mL)，分别设空白孔及标准品孔、待测样品孔。每孔分别加标准品或待测样本100 μL，轻轻摇晃96孔板，覆上板贴，37 ℃温育2 h。每孔加生物素标记抗体工作液100 μL，覆上新板贴，37 ℃温育1h。弃去液体，甩干，洗板3次，每次浸泡2 min，200 μL每孔，甩干。每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100 μL，覆上新板贴，37 ℃温育1 h。弃去液体，甩干，洗板5次，每次浸泡 2 min，200 μL每孔，甩干。依序每孔加底物溶液90 μL，37 ℃避光显色15 min～30 min。依序每孔加终止溶液50 μL，终止反应。450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。

3.2 Arg-1生化活性检测

分别配制0.5 mol/L L-精氨酸、H2SO4/H3PO4(H2SO4∶H3PO4∶H2O=1∶3∶7)、9 % α-异亚硝基苯丙酮、10 μmol/mL尿素，10 μmol/mL尿素梯度稀释32倍至0.3125 μmol/mL后，按两倍梯度稀释0.3125/2,0.3125/4,0.3125/8,0.3125/16,0.3125/32 μmol/mL。分别设空白孔及标准品孔、待测样品孔。每孔分别加100 μL标准品或待测样本和0.5 mol/L L-精氨酸，37 ℃温育30 min。加入800 μL H2SO4/H3PO4后，每孔加入50 μL 9 % α-异亚硝基苯丙酮，95 ℃温育30 min。540 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。

3.3 统计学方法

3.4 结 果

3.4.1 家兔创面组织及血清中iNOS含量

模型组自造模第3天起iNOS升高，之后无明显变化，其余各组创面组织及血清中iNOS含量呈升高—降低趋势(P<0.01)。第3天，各组iNOS含量差异无统计学意义(P>0.05)；第7天，空白组iNOS含量较前相比明显降低(P<0.05)，与其他组相比有统计学意义(P<0.05)；第14、21天：各组与前一时间点相比iNOS含量均有统计学意义(P<0.05)，复方五凤草液高、中剂量组、空白组与其他各组相比有统计学意义(P<0.05)，复方五凤草液高、中剂量组无统计学意义(P>0.05)，亲水性纤维含银辅料组、复方五凤草液低剂量组无统计学意义(P>0.05)。见表1、表2。

表1 各时间点各组家兔创面组织中iNOS含量比较

表2 各时间点各组家兔血清中iNOS含量比较

3.4.2 家兔创面组织及血清中Arg-1活性检测

除了模型组之外其他各组家兔随时间变化肉芽组织及血清中Arg-1活性检测数值都呈现增高趋势(P<0.05)。治疗第3天，各组Arg-1含量差异无统计学意义(P>0.05)；治疗第7天，空白组与其他各组相比有统计学意义(P<0.05)；治疗第14天，空白组、复方五凤草液高、中剂量组Arg-1含量增高，与前一时间点相比有统计学意义(P<0.05)，与其他各组相比有统计学意义(P<0.05)；治疗第21天，空白组、复方五凤草液高、中剂量组与其他各组相比Arg-1含量增高明显(P<0.01)。见表3、表4。

表3 各时间点各组家兔创面组织中Arg-1活性检测表达比较

表4 各时间点各组家兔血清中Arg-1活性检测表达比较

4 讨 论

结核性溃疡是临床常见的一种慢性难愈性创面，病程迁延，属临床难治痼疾。抗结核药物化疗是基础治疗，局部外治起到关键作用。近年来，糖尿病[9]、HIV感染者合并TB发病率逐年增加[10]，以及DR-TB甚至甚至XDR-TB[11]的日益增多，使得本病的发病率以及治疗难度都会增加。然而，目前对结核性溃疡的临床及机理研究尚且薄弱。

祖国传统中医药在慢性创面的修复中具有明显优势。复方五凤草液为我院名老中医经验方，结合其病机特点“腐肉难去、新肉不生”研制而成，应用于临床20 a余，疗效确切。该复方由五凤草、白及、猫爪草等组方而成。其中五凤草行水杀虫，祛腐解毒；白及生肌敛疮，止血活血；猫爪草解毒提脓，祛腐消肿。诸药合用，共奏提脓祛腐、活血生肌之效，促进创面愈合。前期研究表明，该药物能更有效地抑制创面TB-PCRct值，促进VEGF、FGF-2的表达，缩短创面愈合时间，提高创面愈合率[12]。

在创面愈合过程中[13]，巨噬细胞活化扮演了重要的角色。正常生理状态下，M 1型(即经典活化的巨噬细胞)出现在创面愈合的早期，促进创面炎症反应，随后在创面浸润密度逐渐降低，转变为M 2型(替代性活化的巨噬细胞)，促进创面的细胞增殖和血管化的形成，完成愈合的整个过程。而在结核性溃疡中，由于入侵的结核杆菌寄宿于巨噬细胞[14]，导致局部特殊微环境的改变，影响巨噬细胞功能状态和活化方式[15]，使得M 1型和M 2型巨噬细胞无法如正常创面进行时像过渡，在临床中则表现为难愈创面中异常炎症滞留和新生肉芽组织减少的状态[16]，即造成“腐肉难去，新肉不生”的局面，导致创面迟迟不愈。因此缪明远等[17]认为，抑制难愈性创面修复后期仍异常活跃的M 1型活化，促使M 2型活化重新占据主导地位，使其接近正常创面M 1和M 2型活化的时像过渡，可能是今后治疗的一个研究方向。

本次实验中，笔者选择了M 1、M 2型巨噬细胞的表型指标iNOS、Arg-1进行观察，比较各组家兔在治疗过程中血清及组织中指标的变化。结果发现：①空白家兔早期iNOS高表达，7 d后逐渐下降，同时Arg-1表达渐增加，表现为创面渐趋愈合。而结核性溃疡模型家兔在整个观察期间iNOS始终处于高表达状态、Arg-1始终处于低表达状态，创面愈合较差。②治疗组与阳性对照组相比，各组3 d组织及血液中iNOS相比均无显著性差异。7 d开始各组组织及血液中iNOS表达均比治疗初起下降，其中14 d、21 d，治疗组高中低浓度三组组织中iNOS下降明显，与治疗初期相比(P<0.01)，与对照组相比有统计学意义(P<0.05)；同样在治疗14 d、21 d，治疗组高中低浓度三组血清中iNOS下降与治疗初期相比(P<0.05)，与对照组相比有统计学意义(P<0.05)。③治疗组与阳性对照组相比，各组3 d、7 d组织及血液中Arg-1相比均无显著性差异(P>0.05)。高、中剂量组创面组织中Arg-1在14 d、21 d与治疗初期相比有统计学意义(P<0.05)，低剂量组及阳性对照组组织中Arg-1在21 d与治疗初期相比有统计学意义(P<0.05)，高、中剂量组14 d、21 d与其余给药组相比有统计学意义(P<0.05)；7 d各组血清中Arg-1的表达无明显差异(P>0.05)，14 d除高剂量组治疗初期相比有统计学意义(P<0.05)，其余各组均无统计学意义(P>0.05)，21 d 各组与治疗初起相比血清中Arg-1的表达有统计学意义(P<0.05)，高剂量组与其余各给药组相比血清中Arg-1的表达有统计学意义(P<0.05)。

实验结果表明，在结核性溃疡中，iNOS持续高表达，而Arg-1 含量偏低，这点与汪毅平的研究相符[7]。同时相比于阳性对照组，在治疗中后期复方五凤草液组能更有效地抑制iNOS的表达，提高Arg-1的含量，与此相应的创面愈合率也高于对照组，而其中高、中剂量组的表现更优于低剂量组。同时笔者发现血液、组织中两个指标具有同步性，两者相比组织中指标变化更为敏感。

通过本次实验，笔者认为，结核性溃疡之所以缠绵难愈，可能与巨噬细胞活化失衡有关，复方五凤草液可能参与了巨噬细胞平衡调节，通过抑制iNOS的过渡表达、促进Arg-1的表达来发挥创面修复的作用。本次试验仅观察2个指标，要阐述疾病的机制显然远远不够。但是本次实验结果，为我们从巨噬细胞极化角度开展结核性溃疡更深入的机理研究提供方向和基础，也使得将该复方中药进一步拓展应用于其他慢性创面从理论上成为可能。需要我们开展更深入的动物药效试验及机制研究去探索与证实，目前相关工作正在进行中。