成骨生长肽衍生物抗去卵巢大鼠骨质疏松作用的实验研究

程露杨 李梅 李璇 丁海峰 张一娜 金迪 刘兴汉 刘蕾

[摘要] 目的 通过建立去卵巢大鼠骨质疏松模型来研究成骨生长肽衍生物对去卵巢大鼠骨质疏松的防治作用。方法 选取3月龄未交配雌性健康SD大鼠48只，按体重随机分为6组，其中5组行双侧卵巢切除术，建立骨质疏松模型，1组行假手术，给药组分别给予一定剂量的ALEN、OPG、OPG1、OPG2。给药12周后，測定骨密度，血清中的钙、磷、碱性磷酸酶、骨钙素。 结果 模型组与假手术组比较，骨密度明显降低（P<0.05）;各给药组及模型组与S组比较，骨密度降低（P<0.05），OGP1组与OGP2组比较，骨密度增加（P<0.05）;模型组与假手术组比较，碱性磷酸酶活性明显升高（P<0.05）;治疗组与模型组比较，碱性磷酸酶活性明显降低（P<0.05）;与假手术组比较，其他各组骨钙素活性高（P<0.05）;其他治疗组分别与阿伦磷酸钠治疗组比较，血清钙浓度升高（P<0.05）;各治疗组分别与模型组比较，血清磷浓度增高（P<0.05）。 结论 成骨生长肽及其衍生物对去卵巢大鼠骨质疏松具有治疗作用，其中OGPA1对抗去卵巢大鼠骨质疏松的作用较好。

[关键词] 骨质疏松症;成骨生长肽;去卵巢;阿伦磷酸钠;骨密度

[中图分类号] R58          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）16-0038-03

[Abstract] Objective To study the preventive and therapeutic effects of anti-osteoporosis of osteogenic growth peptide in ovariectomized rats by establishing osteoporosis model in ovariectomized rats. Methods A total of 48 3-month-old unmated female healthy SD rats were selected and randomly divided into 6 groups according to body weight. Five groups underwent bilateral ovariectomy to establish osteoporosis model. One group underwent sham operation. The drug-administered groups were given a certain dose of ALEN， OPG， OPG1， OPG2， respectively. After 12 weeks of administration， bone density， calcium， phosphorus， alkaline phosphatase， and osteocalcin in serum were measured. Results The bone density decreased significantly in the model group compared with that of the sham operation group（P<0.05）. The bone mineral density decreased in each drug-administered group and the model group compared with that of the S group （P<0.05）. The OGP1 group showed an increase in bone density compared with OGP2 group（P<0.05）. Compared with that of the sham operation group， the alkaline phosphatase activity was significantly increased in the model group （P<0.05）. The alkaline phosphatase activity was significantly lower in the treatment group than that of the model group （P<0.05）. Compared with that of the sham operation group， the activity of osteocalcin was higher in other groups（P<0.05）. The serum calcium concentration was higher in the other treatment groups than that in the alendronate treatment group（P<0.05）. The serum phosphorus concentration was increased in each treatment group compared with that of the model group（P<0.05）. Conclusion Osteogenic growth peptide and its derivatives have therapeutic effects on osteoporosis in ovariectomized rats. And OGPA1 has a better effect on osteoporosis in ovariectomized rats.

[Key words] Osteoporosis; Osteogenic growth peptide; Ovariectomy; Alendronate; Bone mineral density

骨质疏松症（osteoporosis，OP）被世界卫生组织列为中老年人三大疾病之一，在常见病中位居第6位[1，2]，引起了全世界的重视。探讨如何早期发现并有效防治骨质疏松症，研究治疗骨质疏松安全有效的药物对于减轻国家和社会的经济负担、提高人民的生活质量有着重要的意义。目前治疗骨质疏松的药物分为促进成骨和抑制破骨两大类，其中成骨生长肽在促进骨形成方面有着重要的作用，国内外很多专家学者致力于开发具有双重及多重作用的抗骨质疏松药物，在成骨生长肽结构的基础上进行加工修饰[3，4]，得到众多衍生物，对骨质疏松的防治作用具有重要的研究价值。

1 材料与方法

1.1实验动物

未交配雌性SD大鼠，3月龄，体重230～290 g。购自哈尔滨医科大学附属第二医院动物中心，SPF级，动物合格证：SCXK（黑）2013-001。

大鼠48只，按体重随机分为6组，其中5组行双侧卵巢切除术，建立骨质疏松模型，1组行假手术，分别为：①模型组（M组），术后12周后给予磷酸盐缓冲液每日腹腔注射;②阿伦磷酸钠治疗组（ALEN 治疗组），术后12周后給予ALEN 100 μg/kg每日腹腔皮下注射;③假手术组（S组），术后12周后给予磷酸盐缓冲液每日腹腔注射;④成骨生长肽治疗组（OGP治疗组），术后12周后给予OGP 0.5 μg/kg每日腹腔注射;⑤成骨生长肽衍生物1治疗组（OGPA1治疗组），术后12周后给予OGPA1 0.5 μg/kg每日腹腔注射;⑥成骨生长肽衍生物2治疗组（OGPA2治疗组）。

1.2 实验试剂

OGP及OGP衍生物（OGPA1、OGPA2）由哈尔滨医科大学生化教研室提供，10%水合氯醛溶液（哈医大二院实验中心），青霉素（哈药三精），PBS（嘉茂生物），ALEN（西安丹页），骨钙素试剂盒（上海西唐）。

1.3 OVX模型制备

各组动物以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，除 SHAM组外其余各组大鼠均行OVX，SHAM组以同样方式找到卵巢后切除卵巢周围脂肪组织，卵巢不予切除即分层缝合。

1.4 标本收集与处理

给药12周后，大鼠称重，腹主动脉放血处死，血液室温静置4 h后1000 r/min离心15 min，分离血清，-20℃保存，备作血清骨转换生化指标检测;分离左侧胫骨，尽量去除肌肉及筋膜，分离第1～4腰椎即L1～4，注意保护横突及棘突，骨标本包裹于生理盐水浸透的纱布中，-20℃保存，备作骨密度测量。

1.5 检测方法

在VIATLAB Micro-Ⅱ半自动生化分析仪上采用连续监测法检测血清钙、磷、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨钙素浓度。双能X线骨密度仪（美国Lunar）小动物软件测定BMD。

1.6统计学方法

采用SPSS 24.0统计软件，正态分布变量，满足齐性行方差分析、协方差分析，组间比较采用SNK法或LSD法;方差不齐时，行变量变换或用Dunnetts T3法。非正态分布变量采用非参数检验。统计学显著性水准α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 各组大鼠血Ca、P水平比较

见表1。其他治疗组分别与A组比较，Ca 浓度升高，差异有统计学意义（P<0.05）;各治疗组分别与M组比较，P浓度增高，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 各组大鼠血ALP、OC水平比较

见表2。各组大鼠血ALP、OC水平分别与S组比较，OC活性升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与M组、A组、OGP2组、OGP组比较，OGP1组 OC活性升高明显，差异有统计学意义（P<0.05）;与M组比较，OGP1组、A组、OGP2组、OGP组ALP活性降低，差异有统计学意义（P<0.05）;M组与S组比较，ALP活性升高，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3 各组大鼠胫骨BMD比较

见表3。各组分别与S组比较，各组骨密度均低于假手术组（S组），差异有统计学意义（P<0.05）;OGP1组与其他手术组比较，骨密度高于其他手术组，差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

绝经后OP是由于绝经后雌激素分泌明显减少，诱导破骨细胞活跃导致骨吸收大于骨形成的OP。雌性大鼠去势模型，作用因素单一，实验操作简单，形成机制与人类Ⅰ型OP发病机制相似，结果稳定，已被普遍接受。在本实验中，我们选用去势雌性大鼠作为OGP及其衍生物防治OP的动物模型，大鼠自去势术后12周开始给予各种干预因素，用以观察对OP的治疗效果。OP模型组BMD 低于假性手术组，差异有显著意义，说明动物模型复制成功[5，6]。

本研究发现与ALEN组比较，其余治疗组血清Ca浓度增高，与模型组比较，治疗组P水平均增高。提示成骨生长肽及其衍生物可以提高血中钙磷含量，促进骨形成。

骨转换是OC[7]不断吸收旧骨和成骨细胞不断形成新骨的过程，该过程也称骨重建。破骨细胞活动所降解的骨基质成分片段，和成骨细胞形成新骨释放的物质进入血液和尿中，构成了骨吸收指标和骨形成指标[8，9]。检测骨形成的常用指标之一是血清总ALP，血清ALP升高是骨转换增加的结果。血清OC水平与骨的更新速度密切相关[10]，是反映骨形成的特异性标志[11，12]。体内、外研究表明，OGP具有促进骨形成的作用，其衍生物是否保留了这种作用，本实验选用血清骨形成标志ALP和OC来观察OGP衍生物（OGP1和OGP2）促进骨形成的作用。术后12周，治疗组血清ALP活性较假手术组明显降低，有统计学差异，表明成骨生长肽及其衍生物能显著降低ALP的活性，让骨形成多于骨吸收，骨量保持平衡而不丢失;血清OC水平与S组有显著升高，显示成骨活跃。以上改变提示OGP衍生物对OVX大鼠的骨形成具有一定的刺激作用。

目前OP诊断主要依据BMD测定[13]，对骨质疏松的早期诊断、骨折风险的预测和防治措施的评估均有重要意义。本实验选用DEXA观察OVX及OGP衍生物对大鼠离体BMD的影响。BMD测量结果显示：与 OGP2组比较，OGP1组BMD增加，说明OGP1增加OVX大鼠BMD较OGP2好。

在免疫研究中[14]，Estrogen缺乏时，巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、RANKL表达增加，T细胞增多，TNF、IL-1产生增多，OC分化增殖增多，生存期延长，骨吸收增强，同时OB凋亡增多，骨形成不足以代偿骨吸收，使骨量减少，骨小梁变细，小梁间隙增宽，发生骨质疏松[15]。B淋巴细胞在PMOP中的作用在衰老和Estrogen缺乏中B细胞的改变是有证据可查的，但在OP中却知之甚少。近年大量证据表明其与骨代谢之间的关系密切。B淋巴细胞的改变可能在一定程度上增加了骨质疏松性骨折的发病率和病死率。本实验加入增加免疫成分的成骨生长肽衍生物具有较好的抗骨质疏松作用，其发挥作用的机制可能为在原有OGP促进骨形成的基础上同时能够增强免疫，使OVX大鼠具有良好的免疫状态，延缓了骨流失的进程。

综上所述，重组人成骨生长肽衍生物（OGP1、OGP2）可有效地防止卵巢切除大鼠的骨丢失，使骨在建量呈平衡状态，从而有效地阻止骨质疏松症的发展，是临床上治疗妇女绝经或卵巢切除后形成的骨质疏松症很有潜力的药物。

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（收稿日期：2019-03-08）