血清miR-19a与MMP-9表达水平与骨肉瘤临床病理及预后的关系探讨

梁一民 潘寒松

[摘要] 目的 探討血清miR-19a与基质金属蛋白酶9（MMP-9）表达水平与骨肉瘤临床病理及预后的关系。 方法 选择2016年1月～2017年6月间我院收治的骨肉瘤患者81例作为研究对象，设为骨肉瘤组，同期选取在我院体检的健康人群35例作为对照组。比较两组受试者的血清miR-19a与MMP-9表达水平变化情况，分析骨肉瘤患者血清miR-19a与MMP-9表达水平与临床病理参数的关系，术后随访12个月，比较复发者和未复发者血清miR-19a与MMP-9表达水平变化情况。 结果 骨肉瘤组患者的血清miR-19a与MMP-9表达水平均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。血清miR-19a与MMP-9表达水平与骨肉瘤患者的年龄、性别、肿瘤大小无明显相关性（P>0.05）;但TNM分期Ⅱb/Ⅲ者高于Ⅱa分期者，远处转移者高于未转移者，术后随访12个月，复发组的血清miR-19a与MMP-9表达水平均高于未复发组，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 骨肉瘤患者血清miR-19a与MMP-9表达水平明显升高，其可能参与了骨肉瘤的发生发展，术后对其检测在骨肉瘤患者的预后判断中具有一定价值。

[关键词] 血清;miR-19a;MMP-9;临床病理;预后判断

[中图分类号] R738.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）16-0017-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between serum miR-19a and matrix metalloproteinase-9（MMP-9） expression levels and clinicopathology and prognosis of osteosarcoma. Methods 81 patients with osteosarcoma who were admitted to our hospital from January 2016 to June 2017 were selected as the study subjects and were assigned to the osteosarcoma group. In the same period， 35 healthy people who received physical examination in our hospital were selected as the control group. The changes of serum miR-19a and MMP-9 expression levels in the two groups were compared. The relationship between serum miR-19a and MMP-9 expression levels and clinical pathological parameters in the patients with osteosarcoma was analyzed. The follow-up was carried out for 12 months after surgery to compare the changes of serum miR-19a and MMP-9 expression levels between the patients with recurrence and the ones without recurrence. Results The serum levels of miR-19a and MMP-9 in the osteosarcoma group were higher than those in the control group， and the differences were statistically significant（P<0.05）. There was no significant correlation between serum miR-19a and MMP-9 expression levels and age， gender and tumor size of osteosarcoma patients（P>0.05）; however， those with TNM stage Ⅱb/Ⅲ were higher than those with stage Ⅱa， and those with distant metastasis were higher than those without metastasis. After 12 months of postoperative follow-up， the expression levels of serum miR-19a and MMP-9 in the recurrent group were higher than those in the non-recurrent group， and the differences were statistically significant（P<0.05）. Conclusion The expression levels of serum miR-19a and MMP-9 in osteosarcoma patients are significantly increased， which may be involved in the occurrence and development of osteosarcoma， and their postoperative determination has a certain value in the prognosis of patients with osteosarcoma.

[Key words] Serum; miR-19a; MMP-9; Clinical pathology; Prognosis judgement

骨肉瘤是临床上常见的恶性肿瘤之一，好发于10～25岁的儿童和青少年，具有高恶性度和强侵袭性等特点，是导致青少年致残和致死的重要原因[1]。据文献统计表明，1/5的患者确诊时已转移，预后较差[2]。目前，临床上骨肉瘤的治疗主要以手术和化疗为主，但研究显示，患者的5年生存率仅为20%左右，而肿瘤转移和术后复发是影响患者治疗效果和生存率的重要因素[3]。MMP-9为机体的一种蛋白水解酶，具有促进瘤内血管生成的作用。研究显示，其与多种肿瘤的发生发展相关[4]。近年来，miR已成为肿瘤研究的热点，目前已发现的miR多达上千种，在不同肿瘤中均发现了不同miR的特异性表达。研究表明，miR-19a在肝癌及癌旁组织中呈差异化表达[5]，在胃癌和健康人群中也呈差异化表达。还有研究表明，miR-19a与骨肉瘤患者的预后关系密切[6]。本研究通过观察健康人群和骨肉瘤患者的血清miR-19a与MMP-9表达变化情况，并分析其与骨肉瘤患者临床病理及预后的关系，旨在为骨肉瘤的临床诊治提供参考。

1资料与方法

1.1一般资料

选择2016年1月～2017年6月间我院收治的行骨肉瘤根治切除术患者81例作为研究对象，设为骨肉瘤组，患者均符合《骨肉瘤临床循证诊疗指南》[7]中的相关诊断标准，并经X线、病理检查确诊。同期选取在我院体检的健康人群35例作为对照组。纳入标准：①符合上述诊断标准，且入院前未接受手术和（或）抗肿瘤治疗者;②初次发病者;③知情、自愿参与本研究者。排除标准：①入院前曾接受手术或抗肿瘤治疗者;②临床资料不完整者;③妊娠或哺乳期妇女;④精神疾病者;⑤合并其他肿瘤者。对照组中，男19例，女16例，年龄13～25岁，平均（19.52±3.46）岁。骨肉瘤组中男43例，女38例，年龄13～24岁，平均（19.79±3.65）岁，TNM分期Ⅱa期49例，Ⅱb/Ⅲ期32例。本研究得到两组受试者签署知情同意书，并得到我院伦理委员会核准。两组受试者的基本资料比较差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2检测方法

两组受试者均于入院第2天（对照组为体检当天）清晨空腹外周静脉采集血液标本5 mL，医用离心机3000 r/min，离心15 min，分离血清，保存于-60℃冰箱待测。miR-19a采用实时荧光定量PCR进行检测，用miRNeasy提取试剂盒提取血清中的miRNA，M-MLV逆转录酶进行逆转录（cDNA），qRT-PCR的条件如下：95℃ 5 min，95℃15 s，60℃ 1 min，总共40个循环。将溶解度曲线温度设定为60℃～95℃，每个样品重复测定3次，取平均值。采用2-△△Ct法计算血清中的miR-19a水平。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中MMP-9水平，测量3次取平均值。miRNeasy提取试剂盒购自QIAGEN公司，ELISA试剂盒购自上海一研生物科技有限公司，所有检测均严格按照试剂盒及仪器说明书进行操作。

骨肉瘤组患者于术后1个月再次清晨空腹外周静脉采集血液标本5 mL，采用上述方法检测miR-19a与MMP-9表达水平，并随访12个月，统计复发况。

1.3观察指标

观察两组受试者的血清miR-19a与MMP-9表达水平变化情况，以及与骨肉瘤患者临床病理参数的关系，术后随访12个月，比较复发组和未复发组的血清miR-19a与MMP-9表达水平变化情况。

1.4统计学分析

本研究采用SPSS19.0进行数据分析，miR-19a与MMP-9表达水平等计量资料比较采用t检验及单因素分析，计数资料采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1两组受试者血清miR-19a与MMP-9表达水平变化情况比较

与对照组比较，骨肉瘤组患者的血清miR-19a与MMP-9表达水平均明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2骨肉瘤组患者的血清miR-19a与MMP-9表达水平与临床病理参数的相关性

血清miR-19a与MMP-9表达水平与骨肉瘤患者的年龄、性别、肿瘤大小无明显相关性（P>0.05）;但TNM分期Ⅱb/Ⅲ者高于Ⅱa分期者，远处转移者高于未转移者，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3术后随访12个月复发组和未复发组的血清miR-19a与MMP-9表达水平比较

术后随访12个月，复发组的血清miR-19a与MMP-9表达水平均高于未复发组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

3讨论

骨肉瘤多起源于长骨干骺端，是一种原发性间叶组织恶性肿瘤，好发于儿童和青少年，约占儿童肿瘤的5%[8]。骨肉瘤早期症状主要是发病部位的肿胀和疼痛，特异性不高，易导致临床上误诊和漏诊，研究表明，大部分患者确诊时已出现远处转移，预后较差[9]。由于骨肉瘤恶性程度高、侵袭性强，临床治疗后缓解期的患者也存在极高的复发风险，但目前尚缺乏对骨肉瘤早期诊断及预后评估的肿瘤标记物[10]。临床上寻找特异性强、方便检测及有效的生物标志物在骨肉瘤的早期诊断及预后评估中具有重要意义。

MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其通过各种途径参与机体的发育、病毒防御、细胞增殖和凋亡及肿瘤发生等生物学过程的调控[11]。有研究显示，miR-19a在多种肿瘤中差异化表达，与肿瘤的发生、进展关系密切[12]。研究表明，肝癌组织中miR-19a的表达水平明显高于癌旁组织，miR-19a的表达与组织学分级、TNM分期和血管侵犯有关，miR-19a的高表达与肝癌患者预后不良有关[13]。本研究结果发现，骨肉瘤组的miR-19a水平明显高于对照组，提示miR-19a可能参与骨肉瘤的发生、发展，进一步分析miR-19a水平与临床病理参数间的关系发现，TNM分期Ⅱb/Ⅲ者、远处转移者的miR-19a水平高于Ⅱa分期者和未转移者，表明miR-19a的异常表达与患者预后关系密切，与张智勇等[14]研究中miR-19a在胃癌组织中高表达，miR-19a的高表达与肿瘤浸润深度、TNM分期和淋巴结转移相关，miR-19a也是影响胃癌预后的危险因素。骨肉瘤的特征是侵袭性强和转移率高，患者常伴有远处转移性病变，使得治疗异常困难[15]。MMP-9是MMPs家族的一员，是一种锌离子依赖性蛋白水解酶，主要功能是降解和重塑细胞外基质的动态平衡，大量研究表明，其与肿瘤的浸润、转移和肿瘤内血管形成关系密切[16-17]。体外研究表明，下调MMP-2和MMP-9表达水平可抑制肺癌侵袭和转移的能力[18]。本研究发现骨肉瘤组的MMP-9表达水平也明显高于对照组，且TNM分期Ⅱb/Ⅲ者、远处转移者MMP-9水平高于Ⅱa分期者和未轉移者，表明MMP-9也参与骨肉瘤的发生、发展，且与患者病理分期和是否转移关系密切。因此，miR-19a与MMP-9具有作为骨肉瘤生物标志物的潜力。此外，骨肉瘤具有高致残率、致死率和复发率[19]，本研究随访12个月观察术后复发组和未复发组的血清miR-19a与MMP-9表达水平，结果发现，复发者的血清miR-19a与MMP-9水平均高于未复发者，提示miR-19a与MMP-9高表达水平与骨肉瘤患者预后不良有关，对其检测在患者预后评估中具有较高价值，与Gieger TL等[20]研究结果一致。

综上所述，骨肉瘤患者血清miR-19a与MMP-9表达水平明显升高，其可能参与了骨肉瘤的发生发展，对其检测在骨肉瘤患者的病情评估及预后判断中具有一定价值。

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（收稿日期：2019-01-24）[基金項目] 浙江省医药卫生科技计划项目（2017KY713）