低分子姬松茸多糖对D-半乳糖致衰老大鼠的保护作用

樊 丽 许景伟 李世玲 李雪岩 马立威

随着人口老龄化问题日趋严峻，衰老和延缓衰老是当今社会共同关注的问题，其中脑老化是机体衰老的重要表现。学习记忆能力下降甚至阿尔茨海默症、帕金森病等发生率呈逐年上升趋势[1]。海马是与学习记忆相关的主要脑区，易受氧化损伤的影响，体内高氧化应激状态可导致衰老的观点得到较为广泛的认同[2，3]，因此，抗氧化可以有效防治脑衰老的发生、发展。姬松茸又名巴西蘑菇，是珍贵的食药兼用的真菌。富含多糖、蛋白质等营养成分，姬松茸多糖是从其子实体中分离提取的β型葡聚糖，低相对分子质量多糖(<50000)较高相对分子质量多糖易于进行结构修饰，具有通过结构改造提高药效的潜在价值。LMPAB具有增强免疫，抗氧化及抗肿瘤等效应,但其抗衰老的研究鲜见报道，本研究采用皮下注射D-半乳糖制造大鼠衰老模型，通过水迷宫等行为学实验，氧化相关指标及细胞凋亡的检测等，观察低分子姬松茸多糖对D-半乳糖致衰老模型大鼠的学习记忆及抗氧化的影响[4～6]。

材料与方法

1.实验动物:SD大鼠50只，雄性，无特定病原体(SPF)级，3月龄，体质量180～200g，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供。实验动物许可证号：SYXK(黑)2016-001。饲养环境安静，自然通风，室温25℃，相对湿度45%～75%。光线正常明暗交替，自由进食，饮水。

2.药品与试剂:LMPAB(纯度≥95%，批号SXJR170311-16)购自陕西金润生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷肌甘肽过氧化物酶(glutathione-PX GSH-PX)、丙二醛(MDA)和蛋白含量检测试剂盒购自南京建成生物公司；β-半乳糖苷酶染色试剂盒购自碧云天生物技术公司；凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。

3.仪器:FACS Calibur流式细胞仪，购自美国BD公司； Safire 2酶标仪，购自奥地利Tecan公司；Morris水迷宫视频跟踪系统，购自成都仪器厂；大鼠避暗仪IXeye ShuttleBox穿梭避暗实验系统，购自成都泰盟软件技术有限公司；倒置荧光显微镜，购自德国Zeiss公司。

4.动物分组与衰老模型建立：SPF级SD大鼠50只，雄性，3月龄，体质量180～200g。随机分为正常对照组，衰老模型组，LMPAB组(100、200、400mg/kg)，每组10只。衰老模型组皮下注射D-半乳糖(300mg/kg)每天1次连用42天; LMPAB组注射D-半乳糖剂量与时间同衰老模型组，同时腹腔分别注射LMPAB；正常对照组皮下及腹腔注射等量0.9%氯化钠注射液每天1次连用42天。经水迷宫实验验证造模成功。

5.Morris水迷宫实验：Morris水迷宫是测量啮齿类动物空间学习记忆能力的经典方法。仪器主要由一直径为120cm、高50cm的圆形水池和一可移动位置的平台组成，水池上空通过一摄像机与监视器和计算机连接。水池里水温控制在23±2℃，平台、水、池壁均染成黑色以隐蔽平台，水中不能明显见到安全平台。水池等分为 4 个象限，将平台放在第3象限中间，在4个象限中点位置分别将大鼠面向水池壁放入水中。实验过程中水池及周围环境保持不变。当设定的训练时间已到或大鼠已爬到平台，计算机停止跟踪并记录下游泳轨迹和自动计算出大鼠在水池中所游过的路程、时间、速度等。实验历时4天，每天每只鼠训练4次，第5天去除平台，任选一个入水点将大鼠放入水中，记录60s。

6.避暗反应实验：实验前先将大鼠放入避暗仪反应箱中训练5min，正式测试开始时将大鼠背对洞口放入明室，大鼠进入暗室则受到交流电电击，避暗仪自动记录5min内大鼠进入暗室的次数(即错误次数)和首次进入暗室前在明室的停留时间(即避暗潜伏期)。共测试7天，记录5min内错误次数和避暗潜伏期，将每只大鼠7次结果的均值进行统计分析。

7.海马神经细胞凋亡检测：制备单细胞悬液，用冷的PBS洗涤细胞，用 1ml 1×的 Binding Buffer 悬浮细胞，300×g离心10min，弃上清，调整细胞密度为1×106个/毫升，每管加入100μl细胞。再向管中加入5μl AnnexinV-FITC。 室温，避光，轻轻地混匀，10min。加入5μl PI，室温，避光，孵育5min。加入PBS至500μl，轻轻混匀。在1h内用流式细胞仪检测。

8.脑组织氧化指标的测定:大鼠行为学实验结束后24h，将各组大鼠脱臼处死，迅速取左侧大脑组织置于冰上，制成10%组织匀浆，按照试剂盒说明书测定脑组织SOD、GSH-PX活力和MDA的含量。

9.SA-β-gal染色:每组随机选取5只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，按文献[5]的方法进行脑组织切片的制备。常规方法进行脱蜡和水化处理切片，加入适当的固定液15min,用PBS洗涤3次，每次不少于5min，吸弃PBS，加入适当的染色工作液，37℃过夜，显微镜下观察。

结 果

1.LMPAB对大鼠学习记忆能力的影响:与对照组比较，模型组大鼠在中央活动路程，站台周边路程及站台周边时间明显减少，平均速度明显降低(P<0.01)，逃避潜伏期明显缩短，错误次数明显增多(P<0.01)；与模型组比较，LMPAB高剂量组，中央活动路程，站台周边路程及站台周边时间明显增多，平均速度明显增快(P<0.01)，逃避潜伏期明显延长，错误次数明显减少(P<0.01)，详见图1、表1。

图1 各组大鼠空间探索实验轨迹
A.正常对照组；B.模型组；C.LMPAB低剂量组；D.LMPAB中剂量组；E为LMPAB高剂量组

组别剂量(mg/kg)中央活动路程(cm)站台周边路程(cm)站台周边时间(s)平均速度(cm/s)正常对照组-489.55±74.551185.64±56.5051.22±2.4132.13±1.04模型组-49.54±21.10∗∗347.27±90.31∗∗32.80±3.59∗∗ 13.40±4.65∗∗LMPAB低剂量组100104.98±34.54∗∗ 477.06±51.40∗∗ 37.00±0.94∗∗ 19.13±2.15∗∗#LMPAB中剂量组200237.34±35.73∗∗##765.47±38.49∗∗##43.45±2.79∗##23.77±1.21∗∗##LMPAB高剂量组400374.55±56.24##1071.36±47.51##45.68±2.60##29.32±2.11##

与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

2.海马神经细胞凋亡检测结果：与对照组比较，模型组大鼠海马神经元细胞凋亡率明显增高(P<0.01)；与模型组比较，LMPAB高剂量组海马神经元细胞凋亡率明显降低(P<0.01)，详见图2、表1。

图2 各种大鼠海马神经元凋亡实验结果
A.正常对照组；B.模型组；C.LMPAB低剂量组；D.LMPAB中剂量组；E.LMPAB高剂量组

3.MDA含量、SOD、GSH-PX活性测定：与对照组比较，模型组MDA含量明显增多(P<0.01)，SOD、CAT、GSH-PX活性显著下降(P<0.01)，与模型组比较，LMPAB组MDA含量减少(P<0.01)，SOD、CAT、GSH-PX活性均增高(P<0.01)，且有浓度依赖性，尤其是LMPAB高剂量组与模型组比较，差异有统计学意义，详见表2。

表2 避暗反应及细胞凋亡实验结果

与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

4.各组脑组织切片SA-β-gal染色结果：衰老细胞胞质被染成蓝色，SA-β-gal阳性区域强度用相对吸光度值表示，与对照组比较，模型组相对吸光度值显著增高，与模型组比较，LMPAB组相对吸光度值明显降低，且有剂量依赖性，随剂量的增大相对吸光度值降低，详见图3、图4。

表3 各组大鼠海马区MDA含量及SOD、GSH-PX活性

与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05

图3 LMPAB对衰老大鼠海马区SA-β-gal染色的影响(×200)
A.正常对照组；B.模型组；C.LMPAB低剂量组；D.LMPAB中剂量组；E.LMPAB高剂量组

图4 LMPAB对衰老模型大鼠海马SA-β-gal的比较
与正常对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01

讨 论

多糖具有提高免疫力，抗氧化、抗肿瘤等功效，已成为国内外研究热点[7～9]。与衰老相关的疾病如冠心病、糖尿病、阿尔茨海默病及帕金森病等发生率呈逐年上升趋势。衰老的主要表现为学习记忆能力下降，海马是与之密切相关的脑区[10]。D-gal衰老模型大鼠是研究抗衰老、改善学习记忆能力的经典的动物模型[11]。

本研究通过大鼠行为学实验发现低分子姬松茸多糖能够改善衰老模型大鼠的学习记忆能力。Morris水迷宫实验显示，与模型组比较，LMPAB高剂量组明显提高了中央活动区及平台周围的活动路程，延长了平台周围活动时间，提高了平均速度。避暗反应实验显示，LMPAB高剂量组明显延长了潜伏期，减少了错误次数。

前期研究发现，D-gal致衰老模型大鼠神经元结构具有细胞凋亡的形态特征，核膜出现分叶状凹陷，核质浓缩，边集等，提示细胞凋亡可能参与衰老的病变过程。本研究发现，与模型组比较，LMPAB高剂量组凋亡率明显降低，提示LMPAB具有减少神经元细胞凋亡的功能。

正常情况下，机体的氧化与抗氧化能力是处于动态平衡的，D-gal的氧化机制是氧自由基(超氧阴离子、过氧化氢)在体内累积过量，使细胞膜脂质过氧化，产生过量的MDA，其含量的高低可以间接地反映细胞受损害的程度，使得抗氧化酶SOD、GSH-PX活性降低，SOD可以使体内超氧阴离子歧化生成过氧化氢，以减少自由基对细胞的损伤；GSH-PX是机体内广泛存在的重要的催化过氧化氢分解的酶，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。本研究显示，与模型组比较，LMPAB高剂量组SOD、GSH-PX活性明显升高，MDA含量明显降低，提示LMPAB能够有效清除D-gal诱发的氧自由基继而减轻对大鼠海马组织的氧化损伤。

衰老模型组脑切片SA-β-gal染色相对光密度值较正常组显著增加，表明衰老细胞明显增多，LMPAB组尤其高剂量脑切片SA-β-gal染色相对吸光度值较模型组明显降低，提示LMPAB能够明显改善衰老状态[12]。

综上所述，LMPAB能有效预防因衰老而产生的氧化损伤，改善神经退行性病变及学习记忆能力，为开发预防衰老及神经退行性变、提高学习记忆能力的药物提供了理论基础，其相关机制有待于进一步研究。