两种方法建立树鼩骨质疏松模型的比较实验研究

武羽洁 袁 鑫 角建林 吴 超 郑 红 唐 薇

骨质疏松症(osteoporosis, OP)是一种由于骨量低下，骨微结构损坏，导致骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性骨病，其中患者多为绝经后女性，已被世界卫生组织(WHO)列为十大最严重疾病之一[1]。女性绝经后体内雌激素水平下降,骨量流失加速,导致骨转换加快、骨组织退化以及骨密度的较低,大大提高女性骨质疏松的发生率,不仅严重影响患者的生活质量,还对患者的生命安全存在极大的安全隐患[2,3]。

树鼩(tree shrew)是一种形似松鼠的杂食动物，广泛分布于东南亚的大部分地区，包括印度和中国南部[4]。树鼩在进化过程中处于食虫目与灵长目之间，接近灵长类的小型哺乳动物，由于其具有体形小、脑体质量比高、易驯化饲养、繁殖周期短、寿命较长等特点，在生化代谢、生理机制、大体解剖和基因组等方面接近于人类，是潜在可能替代灵长类的一种新型、极具价值和科学研究需求的实验动物[5]。WHO鼓励用树鼩代替日益濒危的灵长目动物进行动物实验。动物模型是开展OP科研工作的有效工具, 建立理想的动物模型对于探寻OP的发病机制以及研发治疗OP的新方法和新药物等具有重要意义[6]。

卵巢的功能主要是排卵及分泌性激素。参与生育功能及维持月经、对神经内分泌和全身的某些代谢也起到十分重要的调节作用，卵巢产生的雌激素在骨质代谢中也有重要作用。近年来研究表明,子宫不仅是一个受激素作用的靶器官, 而且还能分泌泌乳素、胰岛素生长因子、松弛素、上皮因子、内皮素及细胞因子、酶等多种生物活性物质, 与卵巢、垂体进行精细的内分泌调节[7]。Waston等[8]进行严格实验设计, 结果子宫切除患者尽管保留了双侧卵巢, 仍有明显的骨密度下降。田杰等[9]研究不同术式子宫切除术对患者骨代谢影响时发现患者切除子宫后骨转换加快, 骨吸收大于骨形成, 长期骨代谢处于负平衡状态易导致继发性的骨质疏松。上述研究表明，子宫和卵巢都是影响骨质量的重要因素。去卵巢大鼠模型是一种高转换型OP模型，已被公认为“金标准”模型，但去卵巢法能否建立树鼩OP模型以及效果如何，犹未可知[10]。本研究分析对比了去卵巢和去卵巢子宫两种去势方法建立雌性树鼩OP动物模型的效果，为后续的研究工作提供一定的理论基础。

材料与方法

1.实验动物：45只滇西亚种树鼩，雌性，体质量120±10g，由昆明医科大学实验动物中心提供，普通级。动物使用许可证号：SYXK(滇)2015-0002。

2.仪器与试剂：双能X线骨密度仪(型号：Prodigy,美国GE公司)；电子天平(型号：YP2001N，上海精密科学仪有限公司)；3%戊巴比妥钠(由昆明医科大学实验动物中心提供)。

3.分组：将45只雌性树鼩分为3组，即正常组15只，去卵巢组15只，去卵巢子宫组15只。

4.建模：雌性树鼩用3%戊巴比妥钠(1ml/kg)麻醉后，分别在下腹部两侧各剪一个约1cm的开口，去卵巢组树鼩切除双侧卵巢，去卵巢子宫组树鼩切除双侧卵巢+子宫，在伤口处涂撒适量青霉素后缝合。造模期间的前3天，青霉素肌内注射2×105U/只，预防感染。

5.称量树鼩体质量：术后3、6、9个月，利用电子天平，称量各组树鼩体质量。

6.检测树鼩BMD、BMC：术后3、6、9个月，采用双能X线骨密度仪，将麻醉的树鼩水平置于平台上，空气校准后，分别对各组树鼩进行全身性扫描，获得双能X线骨扫描图像，采用小动物骨密度分析软件，可获得树鼩全身的BMD及BMC。

结 果

1.体质量变化情况：3组树鼩体质量随时间变化情况详见图1，3组树鼩体质量均逐渐增加，但去卵巢组及去卵巢子宫组体重增加幅度比正常组大。在第6个月时，去卵巢组以及去卵巢子宫组树鼩体质量高于正常组树鼩，差异有统计学意义(P<0.05)；在第9个月时，去卵巢子宫组树鼩体质量高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 各组体质量变化情况
与正常组比较，*P<0.05

2.全身骨密度变化情况：在建模后第3个月时，去卵巢组及去卵巢子宫组树鼩全身骨密度显著低于正常组(P<0.01)；且去卵巢子宫组树鼩全身骨密度低于去卵巢组，差异有统计学意义(P<0.05)。术后第6个月和第9个月，去卵巢组及去卵巢子宫组树鼩全身骨密度显著低于正常组(P<0.01)；且去卵巢子宫组树鼩全身骨密度低于去卵巢组，差异有统计学意义(P<0.01)。在术后第6个月时，去卵巢组及去卵巢子宫组树鼩骨密度下降率最大，分别为18.77%和26.65%，详见表1和图2。

表1 两种去势法对骨密度下降率的比较(%)

图2 各组树鼩全身骨密度变化情况
与正常组比较，*P<0.01；与去卵巢组比较，#P<0.05，##P<0.01

3.全身骨矿盐含量变化情况：去卵巢组与正常组树鼩骨矿盐含量比较，差异无统计学意义(P>0.05)；去卵巢子宫组树鼩骨矿盐含量在术后第6个月时显著低于正常组和去卵巢组，差异有统计学意义(P<0.01)；术后第9个月时，各组树鼩骨矿盐含量比较，差异有统计学意义(P>0.05)，详见图3。

图3 各组树鼩全身骨矿盐含量变化情况
与正常组比较，*P<0.01；与去卵巢组比较，#P<0.01

讨 论

骨质疏松症累及多数老年人, 尤其是绝经后老年女性随着年龄增长、卵巢功能衰竭, 雌激素水平降低, 骨量流失会更加严重[11]。严重的骨质疏松症可出现自发性骨折，危及患者的生活质量。影响骨密度的原因很多，其中肥胖的因素越来越受到重视[12]。肥胖和骨质疏松都是机体常见慢性病。肥胖是机体脂肪含量过多或分布异常所造成的一种病态表现，世界卫生组织(WHO)将BMI>30kg/m2人群定义为肥胖。在中国随着居民生活方式和饮食结构的改变，肥胖的流行率逐渐增高，至2010年我国肥胖人口已达1.2亿，肥胖及其相关慢性疾病已成为我国当今重大的公共卫生问题[13]。女性绝经后，体内激素及神经内分泌环境波动较男性显著，在特定时期易于出现体脂的沉积或再分布。主要是由于成年向老年过渡阶段内分泌暂时紊乱、雌激素分泌减少而肾上腺皮质功能代偿性亢进，糖皮质激素分泌增多而促进脂肪吸收和储存。另一方面，随着年龄的增长，机体各系统器官趋于衰退，细胞代谢缓慢，消耗能量也趋于减少，再加上运动量减少、营养过剩等从而造成肥胖[14]。本研究采用去卵巢法和去卵巢子宫法建立树鼩OP模型，在建模第6个月去卵巢组和去卵巢子宫组树鼩体质量显著高于正常组树鼩，与女性绝经后体质量增加结果一致。

根据世界卫生组织的提出的诊断骨质疏松症的“金标准”是通过双能X线骨密度仪测量BMD，当BMD值≤正常年轻人2.5个标准差(T值≤-2.5)时，即可确诊为骨质疏松症。BMD是直接对骨骼的量化诊断指标，常用于诊断骨质疏松症，预测骨折风险和评定治疗效果[15]。BMC是指被测量骨所含矿物质的总量，亦是反应骨质量的重要指标。本研究观察到，去卵巢法和去卵巢子宫两种去势方法均能造成树鼩BMD下降，且在术后第6个月出现最低谷。术后第6个月去卵巢组和去卵巢子宫组树鼩BMD分别下降了18.77%、26.65%。去卵巢子宫组树鼩BMC在第6个月显著低于正常组和去卵巢组树鼩。上述结果表明，采用去卵巢子宫法建立树鼩OP模型效果更优。

综上所述，采用去卵巢子宫手术法建立树鼩骨质疏松动物模型更优，且术后的第6个月为建模的最佳时期。