甜瓜皇后及其姊妹系和亲本材料的ISSR分析

张永兵，李寐华，张学军，杨 永，伊鸿平

(新疆农业科学院哈密瓜研究中心，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】新疆甜瓜(CucumismeloL.)的栽培历史悠久，地方品种资源数量多、分布广，新疆独特的生态气候条件下种植生产的甜瓜即哈密瓜质地松脆、风味独特，是新疆的重要经济作物之一[1]。20世纪80年代，甜瓜育种家吴明珠院士团队利用远生态和多亲复合杂交技术选育出皇后及多份稳定的姊妹系材料，皇后(品种审定名新密1号)的选育拓宽了哈密瓜的遗传背景，使该品种既保留了哈密瓜特有的风味又改良了哈密瓜地方品种的抗病性和适应性，成为当时我区哈密瓜商品生产基地的主栽品种，实现了我区哈密瓜品种第一次更新换代，也为后期哈密瓜的杂种优势利用奠定了材料基础[2，3]。在农作物杂种优势利用中，亲本选择是配制优势组合、有效利用杂种优势的关键环节，全面、系统的了解亲本材料的亲缘关系和遗传多样性，有助于减少亲本选配的盲目性、提高新品种的选育效率[4]。【前人研究进展】以往判断亲本间的遗传差异或亲缘关系常常通过农艺性状，但农艺性状易受到时空和经验的限制，而DNA分子标记不受基因表达的时空限制和环境人为条件的影响，在研究农作物骨干育种材料遗传差异和多样性方面得到广泛应用[5-8]。尽管在分子水平对新疆甜瓜地方品种进行了遗传多样性和亲缘关系的分析[9-11]，但针对皇后姊妹系及其选育亲本材料间遗传关系的研究仍未见报道。【本研究切入点】20世纪末杂种优势育种研究中，皇后是新疆哈密瓜重要的骨干亲本材料[3]。皇后姊妹系及其部分选育亲本材料是稳定的优良自交系，均可作为哈密瓜杂种优势利用的骨干亲本材料，对这些骨干亲本材料进行遗传多样性的分析，将有助于哈密瓜杂优育种中亲本的选配和利用效率的提高。【拟解决的关键问题】以ISSR标记方法，对皇后及其姊妹系以及其它选育亲本材料进行遗传多样性和遗传关系研究，为新疆哈密瓜新品种选育和遗传改良提供支撑，为哈密瓜骨干育种材料中特异基因的挖掘研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

亲本材料中含笑是金棒子和红心脆杂交后系谱选育出的常规品种。供试材料均由新疆农业科学院哈密瓜研究中心提供。ISSR引物由上海生工生物工程有限公司设计合成。

1.2 方 法

1.2.1 基因组DNA提取

取每份材料3～5个单株生长顶端的1片幼嫩叶片，混合在一起，液氮速冻研磨后，采用CTAB法[12]提取基因组DNA。取每份材料基因组DNA溶液2 μL，利用Q3000超微量紫外分光光度计检测各样品基因组DNA浓度及纯度，将DNA的浓度调整至约20 ng/μL，-20℃保存备用。

表1 供试材料名称、来源和原产地
Table 1 Name, source and origin of materials tested

编号Code品种名Name来源Source原产地OriginP1香梨黄地方品种中国吐鲁番市P2黄皮红肉冬瓜地方品种中国南疆地区P3金棒子地方品种中国吐鲁番市P4含笑金棒子 × 红心脆中国鄯善县P5红心脆地方品种中国皮山县P6金黄引进抗源美国L1皇后85系稳定自交系-L2皇后86系稳定自交系-L3皇后88系稳定自交系-L4皇后稳定自交系-L5青边皇后稳定自交系-L6青皮皇后稳定自交系-

1.2.2 ISSR-PCR扩增和电泳检测

ISSR-PCR反应体系为：10 × buffer (不含Mg2+)2.0 μL; dNTP (2 mmol/L) 2.0 μL; MgCl2(25 mmol/L) 1.5 μL; 引物(10 mmol/L)1.0 μL；模板DNA (30 ng/μL)1.0 μL;Taq聚合酶(5U/μL)0.2 μL; ddH2O 12.3 μL，共20 μL。

PCR反应在DNA PTC-200(东胜创新生物技术有限公司)上进行。反应程序如下：94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，进行35个循环，在72℃下继续延伸10 min，4℃保存，整个反应程序约2.5 h。

电泳检测时，取10 μL PCR反应产物与1.5 μL溴酚蓝(0.25%)混合，点样于含0.5 μg/mL EB的1.5%琼脂糖凝胶中，以1×TAE为电泳缓冲液，在5V/cm稳定电压下电泳1.5 h左右。用JS-380B数码凝胶成像分析仪(上海培清科技有限公司)进行分析。

1.3 数据处理

利用Quantity one 软件将300～1 500 bp清晰可见的条带进行标记，经过match比对后，输出由0和1构成的原始数据矩阵。在相同迁移率的位置有条带为“1”，无条带为“0”。利用Popgen1.32软件分析遗传多样性的指标，包括Nei基因多样性指数(Neis Gene Diversity)和Shannon信息指数(Shannons Information Index)。利用软件NTSYSpc2.10计算供试材料之间的遗传相似系数(Jaccard Similarity Coefficient, JC)，按照非加权成对群算数平均法(Un-weighted Pair Group Method with Arithmetic means，UPGMA)进行聚类分析和主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)。

2 结果与分析

2.1 姊妹系和亲本材料的遗传多样性

共筛选了200条ISSR引物，多态性引物为65条，多态性引物所占比例为32.50%。根据Marker迁移距离，ISSR扩增条带大小范围约为300～1 500 bp。用筛选出的65条多态性引物对供试材料分析，共扩增出282个位点，其中多态性位点150个，多态性比例为53.19%，每条引物平均扩增出多态性位点2.31个。通过对ISSR多态性位点分析，皇后姊妹系和亲本材料的Nei基因多样性指数为0.37，Shannon信息指数为0.55，供试材料具有一定的遗传多样性。图1

图1 引物890-4(1-12)和891-1(13-24)对12份材料扩增结果
Fig. 1 PCR profile of ISSR-890-4 (1-12) and ISSR-891-1 (13-24) in 12 materials

2.2 姊妹系和亲本材料的聚类分析

皇后及其姊妹系和亲本材料的JC遗传相似系数在0.23～0.91，平均值为0.58，表明各份材料间具有一定的异质性，但遗传距离较近。亲本材料金黄与其他供试材料的遗传相似程度最低，JC相似系数平均为0.28。姊妹系中皇后和皇后88系与其他材料的平均JC相似系数分别为0.51和0.53，皇后85系、皇后86系、青边皇后和青皮皇后与其他供试材料的遗传相似度最高，平均JC相似系数大于0.64。供试材料中，亲本金黄与皇后88系的遗传相似度最低(JC值0.23)，而姊妹系皇后86系和皇后88系之间的遗传相似度最高(JC值0.91)。亲本材料金黄与其他供试材料的遗传差异显著，除皇后和皇后88系外，皇后姊妹系间的遗传差异不明显。表2

表2 供试材料间的Jaccard遗传相似系数矩阵
Table 2 Data matrix of JC between any pair of materials tested

P1P2P3P4P5P6L1L2L3L4L5L6P11.00P20.541.00P30.670.631.00P40.640.640.661.00P50.660.700.660.771.00P60.270.240.240.300.321.00L10.700.640.760.680.680.301.00L20.690.640.750.660.680.280.911.00L30.530.530.530.500.480.230.670.651.00L40.530.470.520.600.590.320.540.550.401.00L50.630.620.700.590.590.260.790.790.650.491.00L60.660.580.730.630.650.320.780.790.550.540.741.00平均 Average0.58

根据皇后姊妹系和亲本材料间的JC遗传相似系数，利用UPGMA方法进行聚类分析，构建了各供试材料间的遗传聚类图。在C相似系数为0.63处将所有材料聚类为4个类群，1个大类群Ⅰ和3个只有一份材料的类群Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。

除亲本金黄外，所有亲本材料和大部分皇后姊妹系被聚在类群Ⅰ内，在相似系数0.66处聚类为2个亚类群Ⅰa和Ⅰb。亚类群Ⅰa包括皇后4个姊妹系(皇后85系、皇后86系、青边皇后、青皮皇后)和2份亲本材料(香梨黄、金棒子)，亚类群Ⅰb包括3份亲本材料(黄皮红肉冬瓜、含笑、红心脆)。类群Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ分别只有一份材料皇后88系、皇后和亲本金黄，与类群Ⅰ内的材料具有一定的遗传距离。图2

图2 供试材料JC聚类
Fig. 2 Dendrogram of materials tested based on JC

2.3 姊妹系和亲本材料的主成分

研究表明，第1和第2主成分分别代表了25.0%和14.2%的遗传变异百分比。分析结果表明，除皇后和皇后88系外其余姊妹系间遗传差异不明显，具有聚在一起的趋势。亲本金黄与其余亲本材料和皇后姊妹系间遗传差异显著，而其余5份亲本材料间遗传差异不明显。PCA分析结果与UPGMA聚类分析结果一致。图3

图3 供试材料ISSR主成分
Fig. 3 Principal component analysis of materials tested based on ISSR

3 讨 论

20世纪中期以来，新疆哈密瓜育种经历了地方品种提纯、常规杂交育种、杂种优势育种和现代生物技术育种等阶段，杂种优势育种方法在哈密瓜育种中的应用克服了常规育种的局限性，而皇后在哈密瓜杂种优势育种研究中发挥了重要的作用，20世纪90年代中后期培育的一批哈密瓜新品种如86系列、新皇后系列、早皇后系列和抗病皇后系列等，均是直接或间接利用皇后作为亲本材料培育出的哈密瓜品种，为推动当时哈密瓜产业升级奠定了基础[3]。

植物基因组中含有丰富的SSR即简单重复序列，SSR标记具有很高的多态性，在作物高饱和遗传图谱研究中得到应用[13]。以5或3端加一个锚定碱基的一段SSR序列(16～20个碱基)为引物进行PCR扩增，可以得到多态性高、稳定、重复性好的ISSR标记[14]。研究利用ISSR标记对皇后姊妹系及其亲本材料进行遗传多样性分析，结果表明,亲本金黄与其余供试材料遗传差异显著，而姊妹系中皇后和皇后88系的遗传基础较宽。

研究中皇后姊妹系及其亲本材料的Shannon信息指数为0.55，低于新疆甜瓜地方品种形态性状的Shannon指数值(0.74)[15]，可能原因是研究的亲本材料中地方品种数量太少，而且这些地方品种的原产地范围较狭小。研究中供试材料的Nei基因多样性指数(0.37)略低于Zhang等[11]的研究(0.42)，而供试材料间的平均JC相似系数与Zhang等[11]的研究均为0.51，可能是由于Zhang等[11]的研究材料中使用了野生甜瓜亚种的缘故。Aierken等[16]利用SSR标记对部分新疆甜瓜地方品种和国外甜瓜资源的核基因组和叶绿体基因组进行遗传多样性分析，研究中供试材料的Nei基因多样性指数(0.24)低于研究(0.37)，可能是两项研究中使用的标记类型和供试材料的不同而造成。

杂种优势的大小取决于杂交的两个亲本的遗传差异，理论上两个亲本之间的遗传差异越大，则出现优良后代的几率也越高[17]。然而，有些研究结果显示，杂种后代最大的优势并非来自于遗传差异最大的亲本组合，而是来自遗传距离中等的亲本材料组合[18]。皇后和皇后88系与其余供试材料的平均JC相似系数分别为0.51和0.53，呈现出适中的遗传距离。另外4个姊妹系中，青皮皇后与其余供试材料的平均JC相似系数为0.64，而皇后85系、皇后86系和青边皇后与其余材料的平均JC相似系数均达0.68，可能是在系谱选育过程中注重个别性状选择的结果。农作物育种中，如何科学合理的指导优良杂交组合的配制，除应考虑亲本的配合力、遗传力、农艺性状等其他因素，双亲之间的遗传差异是关键因素，该项研究结果可为哈密瓜杂种优势育种研究和新品种遗传改良提供指导依据。

4 结 论

4.1 通过对6个皇后姊妹系及其6份选育亲本的ISSR遗传多样性分析表明，12份材料的Nei基因多样性指数为0.37，Shannon信息指数为0.55，供试材料具有一定的遗传多样性。UPGMA聚类分析和PCA主成分分析结果一致，亲本金黄与其他供试材料的遗传差异显著，除皇后和皇后88系外，皇后姊妹系间及其与来自新疆的亲本材料遗传差异不明显。

4.2 国外甜瓜抗源的引进利用，使得皇后和皇后88系的遗传基础较宽，并与选育亲本间具有一定的遗传距离，这两份材料尤其是皇后仍可作为哈密瓜杂种优势育种研究和遗传改良的骨干亲本。