外源ALA对克瑞森无核葡萄果实品质的影响

刘晶晶，孙军利，赵宝龙，张梦燕，张 帅

(1.石河子大学农学院，新疆石河子832000；2.特色果蔬栽培生理与种质资源利用兵团重点实验室，新疆石河子832000)

0 引 言

【研究意义】5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, ALA)为生物体内所有卟啉化合物生物合成的关键前体，又是植物体内天然存在的、生命活动所需的、活跃代谢的生理物质[1]。有关5-氨基乙酰丙酸的合成与代谢过程已经得到广泛的研究。克瑞森无核葡萄是欧亚晚熟品种，果粒亮红、椭圆形，虽然长势优良，但其着色不良影响销售。果实色泽不仅受外界环境的影响，而且还受果实内在因素的调控，其调控机理的研究是一直关注的热点问题。【前人研究进展】外源供给试验证明，无论在ALA溶液中浸泡种子，还是在叶片上喷施，它对整个植株都产生生理上的影响[2]。研究发现，外源ALA可促进甜瓜[3]、番茄[4]、西瓜[5]、黄瓜[6]、菠菜[7]和草莓[8]等作物叶片光合作用，增强植株对低温弱光[9]、高温强光[5]、盐渍[10]、干旱[11]等抵抗环境胁迫的能力，显著增加了作物的产量，改善了果实品质。由于光敏素与苹果着色有密切的关系，且ALA是植物光敏素生物合成的前体[12]。王中华等[13]研究证明，ALA处理可以迅速提高苹果果皮中的苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性，而且还可以促进离体条件下苹果果皮花青素的合成。高晶晶等[14]研究发现，ALA处理后的果实花青素含量显著增加，VC、可溶性蛋白、可溶性固形物等含量增加，而可滴定酸的含量下降。改善了果实的外观品质，并且提高了鲜食风味。谢荔[15]对ALA诱导葡萄及苹果果皮花青素的积累机理研究结果表明，使用ALA处理可以显著提高葡萄果实中可溶性糖的含量，降低可滴定酸的含量，并且一定浓度的ALA处理可以显著提高葡萄果皮中花青素的含量。这与汪良驹等[16]在苹果上观察到ALA能促进苹果着色的效应相似，ALA可以促进葡萄果皮中花青苷含量的积累。【本研究切入点】果实的色泽是衡量果品品质的重要指标，也是育种的一个重要选择指标。目前，关于ALA着色效果的研究报道主要集中在桃[17]、苹果[13]、梨[18]等果树上，但有关ALA对克瑞森葡萄着色的效果尚鲜见报道。研究不同浓度外源ALA对克瑞森无核葡萄的果实品质效果。【拟解决的关键问题】以克瑞森无核葡萄为材料，根据新疆葡萄生产现状以及ALA的应用开发状况，研究不同浓度的ALA喷施后，对克瑞森葡萄着色效果、相关酶活性的影响及调控葡萄花青素代谢的生理机制，为新疆地区的葡萄及其他果树的着色效果提供技术支持和理论指导。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验园位于新疆石河子大学农学院试验站的葡萄园，N 43°26′～45°20′，E 84°58′～86°24′，地势平坦，占地面积约13 400 m2，平均海拔高度约为450.8 m。属于典型的温带大陆性气候，夏季短而炎热，冬季长而严寒。

试验树为欧亚品种克瑞森无核葡萄，3年生，果实生长结果正常，株行距为0.5 m×3.5 m，采用单篱架露地栽培，独龙干整形，东西行向，灌溉方式均为沟灌。采摘时间为2016年10月。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

试验选择长势、架势及负载量相似的克瑞森无核葡萄植株，从中选择大小一致的果穗挂牌作为试验材料。试验处理按喷施的ALA浓度分为4个处理：0、50、100和150 mg/L。每个处理选取10穗果，在葡萄幼果期(7月1日)、果实膨大期(7月21日)及转色期(8月10日)对果穗及植株喷施ALA溶液，其中以等量的清水(0 mg/L处理)作为对照。7月23日和8月13日用SPAD-502叶绿素仪测定克瑞森葡萄叶片内叶绿素的相对含量。在10月9日果实完全成熟时进行采样，每个处理选取3穗果，重复3次。迅速带回实验室，测量果实纵、横径。将果肉与果皮进行分离，并用液氮速冻，分别装袋标记并置于-80℃冰箱保存，以备测定其他的生理指标。

1.2.2 测定指标1.2.2.1 果实纵横径

每个处理在果穗的上、中、下部位各选择10粒果，使用游标卡尺测量克瑞森完全成熟时果实的纵、横径，并记录数据。重复3次，取平均值。纵、横径单位表示为mm。

1.2.2.2 叶片叶绿素

于果实膨大期(7月23日)及果实转色期(8月13日)使用SPAD-502叶绿素仪测定克瑞森葡萄叶片内叶绿素的相对含量(SPAD)。选择结果枝自基部向上第12片叶，在叶片不同的3个位置测定叶绿素相对含量2次，每个处理重复3次，取平均值。

1.2.2.3 果实糖酸

可溶性糖的含量测定参考李合生[19]的蒽酮比色法。可滴定酸的含量测定使用酸碱滴定的方法[20]。每个处理中随机选取10粒长势一致的果肉，打碎。均匀称取1 g，重复3次，取平均值。

1.2.2.4 果皮PAL活性

果皮PAL(苯丙氨酸解氨酶)的活性测定参照Lister等[21]方法并加以改进，在采集的每个处理中分别称取1 g克瑞森葡萄的果皮，加入液氮并研磨至粉末状后加5 mL的提取液[0.05 mol/L的Na2HPO4(pH 7.0)；0.018 mol/L的巯基乙醇；0.05 mol/L的抗坏血酸]，冰浴中匀浆，在4℃下，15 000 r/min离心20 min，得到的上清液用于PAL的活性测定。量取1 mL的上清液，加入3 mL反应体系中[0.05 mol/L的L-Phenylalanine(L-苯丙氨酸)，1 mL； 0.2 mol/L pH为8.8的硼酸缓冲溶液，2 mL]，在37℃的水浴中反应90 min，随后加入0.2 mL的6 mol/L HCl结束反应，离心除去沉淀，在290 nm波长下测定吸光值。每分钟改变的光密度变化0.01所需酶量为1个酶活力单位(U)。U/g FW作为酶的活性单位。

1.2.2.5 果皮花青素含量

果皮花青素的含量测定参照仝月澳等[22]方法并加以改进。每个处理分别称取1 g克瑞森果皮，剪碎并混匀，放入刻度试管中，加入10 mL 的0.1 mol/L HCl溶液，将试管口盖紧，置于32℃恒温箱中提取4 h以上，过滤，滤液即为克瑞森果皮花青素的提取液，于530 nm波长下测定吸光值。将读取的光密度值乘以10表示花青素的含量，单位表示为U/g FW。

1.3 数据处理

试验数据使用Excel进行处理，利用SPSS软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 ALA处理对克瑞森葡萄果实纵和横径影响

研究表明，外源ALA处理克瑞森葡萄后，对其果粒纵、横径均有促进效应。外源ALA处理均能提高果粒纵径，且显著高于对照。除50 mg/L的 ALA外，100和150 mg/L的 ALA处理明显促进果粒横径的生长。其中以100 mg/L 的ALA处理果粒纵、横径效果最明显，分别增加了15.72%和15.70%。外源ALA处理果粒果形指数与对照无显著性差异，最大为1.40。经ALA处理，增加了果实的纵、横径，促进了果实发育，提高了果实的大小，且最适浓度为100 mg/L，可增大果实颗粒、提高产量。表1

表 1 ALA处理下克瑞森葡萄果实纵、横径变化
Table 1 Effect of ALA on the longitudinal and transverse diameter in Crimson grape

ALA浓度ALA concentration (mg/L)纵径Longitudinal diameter(mm)横径TransverseDiameter(mm)果形指数Shape index019.71±1.24c14.46±0.95c1.36±0.11a5021.39±1.17b15.36±0.79bc1.39±0.20a10022.81±1.26a16.73±0.93a1.36±0.17a15022.50±1.37ab16.25±1.11ab1.38±0.11a

注：同列中不同小写字母表示P<0.05时的差异显著水平，下同

Note: Different lowercase letters in the same column indicate the significant difference level whenP<0.05, the same below

表2 ALA处理下克瑞森叶片叶绿素相对含量变化
Table 2 Effect of ALA on Chlorophyll relative content in Crimson leaves

ALA浓度ALA concentration(mg/L)叶绿素相对含量Chlorophyll relative content(mg/g) 7月23日 8月13日017.78±1.40b 41.39±2.07c50 18.36±1.88ab 43.83±1.87b10019.94±1.84a 46.37±1.87a15019.40±1.80ab44.82±1.82ab

2.2 ALA处理对克瑞森叶片叶绿素相对含量的影响

研究表明，克瑞森经外源ALA处理条件下， 7月23日，仅100 mg/L的ALA处理差异性最显著，叶绿素相对含量达到19.91 mg/g，平均增幅为11.54%。8月13日，经50、100和150 mg/L的ALA处理，叶片叶绿素相对含量均达到显著性差异，与对照相比分别增长5.89%、12.03%、8.30%。其中以100 mg/L的ALA处理差异性最明显，高达46.37 mg/g，相比于7月23日，平均增长了132.93%。在果实膨大期及转色期，经外源ALA处理，叶片中叶绿素含量迅速升高，光合作用增强，所积累的光合产物也越多，为提高葡萄果实品质提供物质基础。表2

2.3 ALA处理对克瑞森葡萄可溶性糖、可滴定酸及糖酸比的影响

研究表明，与对照相比，克瑞森经不同浓度的ALA处理可在不同程度提升果实可溶性糖的含量，同时降低了可滴定酸的含量。经外源ALA处理后，果肉中可溶性糖含量以 100与150 mg/L ALA处理显著高于对照。以100 mg/L ALA处理效果最为显著，可溶性糖含量高达20.23%，相比于对照增加了58.79%，且显著高于50 mg/L的处理。经外源ALA处理，同样以100 mg/L 的ALA处理效果最显著，总酸度为0.17%，与对照相比降低了23.44%。外源ALA处理下，随着可溶性糖的含量升高，可滴定酸的含量下降，则在不同程度上提升了克瑞森果实的糖酸比。虽100与150 mg/L的ALA处理显著高于对照，但以100 mg/L 的ALA处理效果最为显著，糖酸比高达117.70，平均增幅为106.21%。100 mg/L ALA是促进克瑞森葡萄糖酸的最佳浓度，提高了鲜食风味。图1～3

图1 ALA处理下克瑞森葡萄可溶性糖变化
Fig.1 Effect of ALA on soluble sugar in Crimson grape

图2 ALA处理下克瑞森葡萄可滴定酸变化
Fig.2 Effect of ALA on the titratable acid in Crimson grape

2.4 ALA处理对克瑞森葡萄果皮PAL活性影响

研究表明，经外源ALA处理克瑞森葡萄后，可在不同程度上提高果皮中PAL的活性。与对照相比，各处理均达到了显著水平，各处理之间也达到了显著性水平，其中以100 mg/L的ALA处理促进效果最好，与对照相比平均增幅为82.35%，高达134.33 U/g FW。图4

图3 ALA处理下克瑞森葡萄糖酸比变化
Fig.3 Effect of ALA on the sugar-acid ratio in Crimson grape

2.5 ALA处理对克瑞森葡萄果皮花青素含量影响

研究表明，与对照相比，经外源ALA处理后，对克瑞森果皮花青素的积累均有促进效应，各处理均达到显著性水平。以100 mg/L的ALA处理促进效果最为显著，与对照相比平均增幅为194.71%，高达36.98 U/g FW。50 mg/L与150 mg/L的两个ALA浓度处理之间无差异，但与对照相比具有显著性的差异。外源ALA处理能够有效促进克瑞森葡萄果皮花青素含量的积累，以100 mg/L ALA处理效果最佳。图5

图4 ALA处理下克瑞森果皮PAL活性变化
Fig.4 Effect of ALA on the PAL activity in Crimson peel

图5 ALA处理下克瑞森果皮花青素含量变化
Fig.5 Effect of ALA on the anthocyanin in Crimson peel

2.6 克瑞森果皮花青素与可溶性糖、可滴定酸及PAL活性的相关性

研究表明，克瑞森果皮中花青素与其合成相关的PAL酶活性、果肉中可溶性糖的含量具有极显著正相关关系；与果肉中可滴定酸的含量呈明显负相关关系。花青素含量受PAL酶活性的调节，与可溶性糖含量、可滴定酸含量密切相关。图6

3 讨 论

3.1 外源ALA对果实大小的影响

果实大小与果实纵横径的发育有密切关系。沈苗苗[23]报道显示，同一批中等大小的甜橙果实，在生长期营养状况良好，发育最充实，且营养物质含量最高。10～50 mg/L ALA 处理的小麦产量较对照提高了6.1%～11.6%，其中以30 mg/L的ALA处理增产幅度最大[24]。Elliott[25]在生菜、葱、木兰、草莓等作物上施用ALA处理后，增加了果实的纵、横径，促进了果实生长发育，提高了果实的大小，达到增大果粒、提高产量的目的。

注：**表示在0.05水平上显著相关；***表示在0.01水平上极显著相关

Note:**Indicates a significant correlation at the level of 0.05;***indicates an extremely significant correlation at the level of 0.01

图 6 克瑞森果皮花青素与可溶性糖、可滴定酸及PAL活性的相关系数
Fig. 6 The correlative coefficient of the anthocyanin and soluble sugar, titratable acid and PAL activity of Crimson peel

3.2 外源ALA对叶片叶绿素的影响

叶绿素主要参与光能的吸收、传递和转化[26]，以确保光合作用的正常进行，是参与植物光合作用的重要物质。作为植物生长调节物质，ALA在叶绿素生物合成过程中激活了某些酶类，叶绿体膜及其结构的完整性得到了有效保护[27]，叶片内叶绿素含量的下降速度被抑制，使叶片内叶绿素的相对含量增加。ALA 处理可以提高红掌叶片叶绿素含量，200、 400 mg/L 处理分别较对照提高6.7%和8.5%，进一步证明了ALA 能在绿色植物质体内合成并转化为叶绿素[28]。Hotta等[29]提出，ALA处理会参与调节植物叶绿素的合成。然而，ALA 浓度的变化与叶绿素含量的改变并不存在线性关系，但仅表现出与植物激素调控作用相似的浓度效应。

3.3 外源ALA对可溶性糖、可滴定酸含量的影响

果实内在品质主要指可溶性糖和可滴定酸等营养物质的含量，糖和酸的含量以及其比例决定了果实的风味品质，同时也是果实成熟的重要标志[30-31]。研究结果表明，经过ALA处理后的葡萄果实可溶性糖的含量升高，可滴定酸的含量降低[32]。50～100 mg/L三个ALA浓度处理均与对照呈现显著差异，100、150 mg/L的ALA处理的效果最好，它们的平均值与对照相比，增加幅度为20%，可滴定酸的含量明显降低[15]。这与试验研究结果相符。

3.4 外源ALA对PAL活性的影响

PAL是研究较早[33]、较多的酶，它可以将植物的次生代谢与初生代谢联系起来，是苯丙烷类代谢的关键酶。PAL在花青素的合成过程中不可或缺，并在特定时刻发挥着关键作用。与此同时，还调控着苯丙氨酸到花青苷的第一个阶段。一般来说，经过外源乙稀(乙稀利)、激动素(BAP)和生长素(IAA)处理后，PAL的活性增加[34]，而经过GA3、NAA处理后，PAL的活性降低[35]。王中华等[13]研究发现，经过ALA处理的苹果果皮中PAL活性显著高于对照，并且随着果皮颜色变浅，PAL活性的趋势为先上升后下降。说明ALA处理可以提高PAL的活性。

3.5 外源ALA对花青素含量的影响

花青素基于糖代谢，由苯丙氨酸和乙酸缩合而成的。有研究表明，ALA能促进富士苹果果皮花青素的积累，且其积累量比对照高出1倍以上，还能提高果实的糖酸比，其浓度为300 mg/L的ALA效果最明显[13]。谢荔[15]研究发现，经ALA处理不但可以促进花青素合成的结构基因的表达，而且还可以调控与花青素合成相关的调节基因的表达。0.05～5 mg/L ALA 可以使红星苹果果皮花青素含量提高50%～127%，富士苹果提高140%～230%[14]。

4 结 论

克瑞森无核经外源ALA处理，可显著增加果实纵、横径，提高叶绿素的相对含量，达到促进果实发育、增大果粒、提高产量的目的，且对葡萄叶片正常的光合速率起到了促进作用。同时，提高了可溶性糖的含量，降低了可滴定酸的含量，能大幅度提升糖酸比，增强了果实鲜食风味。且果皮花青素的积累量及合成相关的PAL活性明显升高，克瑞森葡萄果实品质得到了一定的改善，并在一定程度上促进其着色。克瑞森果皮中花青素与其合成相关的PAL酶活性、果肉中可溶性糖的含量具有极显著正相关关系，与果肉中可滴定酸的含量呈明显负相关关系。外源ALA对克瑞森葡萄的促进作用不随其浓度增大而增强，以100 mg/L的ALA处理克瑞森为最佳浓度。