基于全固态离子选择性电极的多巴胺生物传感器研究*

何 成,王 酉,李 光,周武杰

(1.浙江科技学院信息与电子工程学院,杭州 310023;2.浙江大学控制科学与工程学院,杭州 310027)

人类的情感是丰富多彩的,在处于不同的天气、环境和场景时,情感也会随之发生改变,而这些情感的变化都与脑内的神经递质有着密切的关系。

多巴胺(Dopamine)作为中枢神经系统中一种重要的单胺类神经递质,能使人感到兴奋愉悦,还有助于提高记忆力[1]。如果脑内的多巴胺神经系统发生功能紊乱,就会引起相关的神经疾病,比如精神分裂症、帕金森症等[2]。目前,多巴胺在体内的作用机理以及病症原因还未有统一确切的解释。其中的一个主要原因是仍然缺乏十分有效的检测手段,尤其是脑内多巴胺含量的动态监测。

目前,用于多巴胺的检测方法主要有高效液相色谱法[3-4]、荧光标记法[5-6]、核磁共振波谱法[7]和电化学法[8-10]等。相较于谱学分析方法,电化学法不需要昂贵的设备、复杂的预处理过程,具有灵敏度高,响应速度快等特点。在电化学法中,通常以电流作为特征信号来检测多巴胺的含量[11],此类电流型传感器在检测时需要外加电压,在活体检测中会影响周围神经细胞的正常生理活动,且在检测过程中会不断消耗多巴胺[12]。由于多巴胺在酸性环境中具有质子化的特点,也可以采用电压型传感器进行检测。离子选择性电极是其中最具代表性的一类,此类电极在检测时不需要外加电压,可以减少对被测液的影响。此外,由于离子选择性电极良好的动态响应特性,适用于检测神经系统中浓度变化迅速的多巴胺。目前利用电压型传感器检测多巴胺含量的研究并不多,较有代表性的是Othman A M等人制作的传统多巴胺离子选择性电极,将冠醚衍生物作为对多巴胺敏感的离子载体[13]。

传统的离子选择性电极中含有内充电解液,当敏感膜内外的待测离子浓度不同时,待测离子会互相渗透,改变原溶液浓度,影响测量结果。此外,由于内充液的存在,在长时间使用或保存时,内充液会逐渐流失使测量产生偏差[14]。为了克服内充电解液带来的不足,将传统的内充液用固态电解质代替,实现电极的全固态化。固态化后的电极能够降低检测下限,具有体积小,免维护,操作简单,使用寿命长等特点。固态电解质在电极中的主要功能是实现离子-电子的转换,导电聚合物则具备了良好的转换能力。导电聚合物的种类很多,其中用聚(苯乙烯磺酸钠)掺杂的聚(3,4-乙烯二氧噻吩)(PEDOT/PSS)能够维持电位长时间稳定,且具有对O2和CO2(pH)不敏感的特性,是一种理想的固态电解质材料[15-16]。

本文提出了一种全新的基于全固态离子选择性电极的多巴胺生物传感器。在金盘电极表面涂覆PEDOT/PSS作为固态电解质,在骨架材料高分子聚氯乙烯(PVC)中添加离子载体CE-TPB和增塑剂2-硝基苯辛醚(NPOE)合成多巴胺敏感膜,将其固定在固态电解质表面。制备的全固态多巴胺离子选择性电极具有操作简单,检测下限低,反应灵敏,使用寿命长等特点。

1 实验部分

1.1 实验材料与实验仪器

12-冠醚-4,四苯硼钠,2-硝基苯辛醚(NPOE),高分子聚氯乙烯,氯化乙酰胆碱,多巴胺盐酸盐,抗坏血酸,尿素均购自Sigma-Aldrich公司。四氢呋喃,氯化钠,氯化钾,氯化钙,醋酸,醋酸钠,氢氧化钠,苯酚,曲拉通均采购于国药集团化学试剂有限公司。茶多酚购买于江苏德和生物科技有限公司。人工脑脊液购买于北京雷根生物技术有限公司。聚(3,4乙撑二氧噻吩)/聚(苯乙烯磺酸酯)水分散液购买于德国H.C.Starck公司。42号Whatman定量滤纸购自上海必泰生物科技有限公司。所有实验均采用去离子水,由美国Milli-Q净水系统制造。电极检测实验通过CHI660E电化学工作站实现,通过配套软件实时检测和显示电极电压的变化,该工作站购买自上海辰华仪器有限公司。Ag/AgCl参比电极和金盘电极均采购于天津艾达恒晟科技有限公司。pH计购买于Mettler-Toledo股份有限公司。电子天平购自德国Sartorius Intec公司。

1.2 离子载体CE-TPB制备

用于制备多巴胺敏感膜的离子载体在市场上没有销售,需要在实验室合成。分别量取相同体积的浓度均为0.01 mol/L的12-冠醚-4溶液和四苯硼钠溶液,倒入同一烧杯中进行电磁搅拌。将混合均匀的浑浊液倒入滤纸中过滤,并用少量去离子水清洗,将滤纸放入干燥箱中常温干燥24 h,再将滤纸上的白色粉末取下并研磨均匀。存储备用的白色粉末即为用12-冠醚-4和四苯硼钠合成的离子载体CE-TPB。制备的CE-TPB的空穴结构对被测阳离子的大小很敏感,而质子化的多巴胺能够很好地与该离子载体的空穴相匹配[13]。

图1 多巴胺传感器

1.3 全固态多巴胺生物传感器制备

首先配制多巴胺敏感膜液,在四氢呋喃中加入一定比例的骨架材料PVC粉末、增塑剂2-硝基苯辛醚和离子载体CE-TPB,其中PVC与四氢呋喃的比例为1:10(mg/μL)。将配制的混合溶液连续振荡,直到变为澄清透明的粘稠溶液。混合均匀的多巴胺敏感膜液密封保存在4 ℃的冰箱中。

然后在PEDOT/PSS分散液中添加1‰的曲拉通,使其具有更好的扩散性和粘度。将混合均匀的分散液点涂到金盘电极表面,优化后的点涂量为1.5 μL,在干燥箱中放置24 h,形成光滑致密的导电聚合物层。最后在导电聚合物层上点涂4.0 μL多巴胺敏感膜液[15,17],放入干燥箱中干燥24 h,形成光滑透明的PVC膜。制备的全固态多巴胺生物传感器的结构示意图和实物图如图1所示。

1.4 多巴胺检测实验

在多巴胺传感器使用之前,先将传感器浸入去离子水中进行活化,使电压值稳定。多巴胺检测实验采用两电极体系,即采集多巴胺传感器与Ag/AgCl参比电极的电势差作为检测信号,通过电化学工作站及配套软件实时记录电压的变化。所有实验均在室温25 ℃下进行,每次检测持续60 s,并将60 s时的电压值作为检测结果。此外,由于多巴胺见光容易分解的特性,每次实验前均会配制新鲜的多巴胺醋酸/醋酸钠缓冲液。实验结束后,用去离子水清洗多巴胺传感器,放入干燥箱中保存。

1.5 多巴胺敏感膜配方优化

多巴胺敏感膜配比的不同会直接影响传感器的性能。在制备敏感膜时,固定敏感膜骨架材料PVC和增塑剂NPOE的比例不变,约为2∶1[18],改变CE-TPB的含量,测定不同配比下传感器的斜率、检测下限和线性度,具体比例如表1所示。从表中可以看出,CE-TPB含量在1.0%～3.0%之间时,随着含量的增加,传感器的性能得到了一定的提升,其中CE-TPB含量为3.0%时,性能最佳。之后再继续增加含量,传感器性能基本维持现状甚至出现下降。因此,将敏感膜配方确定为32.3%的PVC,64.7%的NPOE和3.0%的CE-TPB。

表1 不同配比下多巴胺敏感膜的传感器性能

2 结果与讨论

2.1 线性范围与检测下限

配制11个多巴胺浓度从10-7mol/L到10-2mol/L的多巴胺醋酸/醋酸钠缓冲液(pH=7.0)。按浓度从低到高的顺序依次检测,重复检测3次,检测结果如图2所示。从图中可以看出,传感器的线性范围为10-5mol/L～10-2mol/L,斜率为(52.09±0.38)mV/decade,与能斯特方程的理论斜率59.16 mV/decade相接近。根据IUPAC的计算方法,可得传感器的检测下限为(7.69±0.77)μmol/L。

图2 多巴胺传感器校准曲线

2.2 选择性系数

为检测研制的多巴胺传感器的抗干扰性能,选取组织液或血液中常见的Na+、K+、Ca2+、乙酰胆碱(ACh)、抗坏血酸(AA)、尿素(Ur)以及多巴胺类似物苯酚(PH)、茶多酚(TP)作为干扰离子。根据固定干扰离子法[19],分别计算多巴胺传感器对不同干扰离子的选择性系数,干扰离子的浓度和实验结果如表2所示。干扰系数的对数越小表示抗干扰能力越强。从表中可以看出,多巴胺传感器对多巴胺的结合能力强于干扰离子约100倍,说明该传感器具有良好的选择性。

表2 多巴胺传感器选择性系数

2.3 pH的影响

多巴胺在不同的pH下化学特性会发生变化,在酸性条件中多巴胺具有质子化的特点,而在碱性环境中多巴胺会发生自聚合现象生成聚二甲基。考察不同浓度不同pH下,传感器对多巴胺的响应特性,如图3所示。由图可知,同一pH不同浓度时,多巴胺传感器具有良好的线性响应特性。在同一浓度时,pH在6.0～7.0的范围内传感器电压基本保持不变,当pH大于7.0时,检测电压随着pH的增加出现下降的趋势,表明缓冲液中质子化的多巴胺离子减少,符合碱性条件下多巴胺易聚合的特征[20]。由此表明,在pH为弱酸或中性环境下传感器的检测效果最佳。

图3 不同pH下多巴胺传感器的检测结果

2.4 动态响应特性

考察加入不同浓度的多巴胺后,传感器的动态响应特性,如图4所示。图中箭头表示在该时刻加入一定量的高浓度多巴胺溶液,整个检测过程用磁力搅拌器搅拌(速率为400 rpm)。从图中可以看出,多巴胺浓度从10-7mol/L～10-3mol/L的增长过程中,传感器均能迅速响应并马上达到稳定,表明该传感器能够实时检测多巴胺大范围的快速变化。这一特性符合神经信号传递时,神经递质多巴胺浓度变化范围广、速度快的特点,为之后研制适用于在体检测的微型多巴胺传感器提供了新的思路和方法。

根据动态响应曲线绘制多巴胺传感器的校准曲线,如图5所示。由图可得,传感器线性范围为10-5mol/L～10-3mol/L,斜率为53.51 mV/decade,检测下限达到1.82 μmol/L。与静态环境下测得的传感器性能相比均有了一定程度的提升,究其原因可能是通过磁力搅拌增强了缓冲液的多巴胺活性,且与传感器表面有了更好的结合,从而降低了检测下限,提高了斜率[21]。

依次加入一定量高浓度多巴胺溶液使缓冲液浓度变为①10-7 mol/L;②3×10-7 mol/L;③10-6 mol/L;④3×10-6 mol/L;⑤10-5 mol/L;⑥3×10-5 mol/L;⑦10-4 mol/L;⑧3×10-4 mol/L;⑨10-3 mol/L图4 多巴胺传感器动态响应曲线

图5 多巴胺传感器动态响应校准曲线

2.5 一致性与重复性

选用同一批次的3个多巴胺传感器检测同一浓度的多巴胺缓冲液,测试传感器的一致性;采用同一个传感器检测3个不同浓度的多巴胺缓冲液,每个缓冲液测3次,检测结果如表3所示。从表中可以看出,3个传感器对同一个浓度的检测结果保持基本一致,且与标定值相接近,说明制作的多巴胺传感器具有良好的一致性;同一传感器多次测量同一浓度所得检测结果与标称值接近,且相对标准偏差在10%以内,表明该传感器具有良好的重复性。

表3 多巴胺传感器一致性和重复性

2.6 使用寿命

检测多巴胺传感器的使用寿命,采用同一个新制的传感器每隔若干天检测多个浓度的多巴胺缓冲液,将传感器斜率作为评价指标。图6表示传感器一个月内斜率的变化情况。可以看出,传感器斜率接近能斯特方程的理论值,在3.00 mV/decade的范围内波动,基本保持稳定,说明该传感器在一个月内能够正常使用。

图6 多巴胺传感器使用寿命

2.7 人工脑脊液中的多巴胺检测

将人工脑脊液作为背景溶液,检测多巴胺传感器的线性范围和检测下限。向人工脑脊液分别加入一定量的高浓度多巴胺溶液,配制成11个浓度从10-7mol/L到10-2mol/L的多巴胺溶液。按浓度从低到高的顺序依次检测,重复检测3次,检测结果如图7所示。

图7 人工脑脊液中的多巴胺传感器校准曲线

从图7中可以看出,传感器的检测下限为(1.80±0.65)μmol/L,线性范围为10-5mol/L～3×10-3mol/L,斜率为(43.23±0.65)mV/decade,与在醋酸/醋酸钠缓冲液中测得的斜率相比有一定程度的下降,可能的原因为人工脑脊液pH为7.1,呈弱碱性,影响了多巴胺的质子化,造成斜率降低。此外,人工脑脊液是一种复杂的混合溶液,包含钾离子、钠离子、钙离子、镁离子、氯离子、碳酸氢根、磷酸二氢根和葡萄糖等多种成分,且浓度相对较高。在检测过程中,这些成分尤其是阳离子,部分聚集到了敏感膜表面,对多巴胺传感器造成干扰。后续可以尝试合成新的多巴胺离子载体进一步提高传感器的抗干扰性。

3 结论

本文研制了一种全新的全固态多巴胺生物传感器。以金盘电极作为传感器主体,将PEDOT/PSS作为固态电解质实现离子-电子的转换功能,最后通过多巴胺敏感膜特异性结合溶液中的多巴胺进行检测。所研制的传感器对多巴胺有极快的响应速度,且具有较低的检测下限,较宽的线性范围,较长的使用寿命,良好的重复性、一致性和抗干扰能力。本研究提出的电压型非酶全固态多巴胺生物传感器为在体神经递质的实时检测提供了新的检测思路。