HPLC法测定注射用青霉素钠含量的不确定度分析

齐亚辉 朱 宝

（1.陕西省动物卫生与屠宰管理站，陕西西安 710016；2.陕西省动物疫病预防控制中心，陕西西安 710016）

1 试验部分

1.1 仪器与试药

岛津2010AHT型高效液相色谱仪，可变紫外检测器，（日本岛津公司）；Nexpower1000纯水超纯水器（德国HUMEN公司）；AUW220D电子分析天平（日本岛津公司）。

青霉素对照品（批号：130437-201707，94.1%，中国食品药品检定研究院）；注射用青霉素钠（批号：E8E180805，规格：0.96g（160万单位），河北远征药业有限公司）；水为超纯水（自制）；乙腈为色谱纯（Merck KgaA 64271 Darmstadt，Germany）；其他试剂均为分析纯。

1.2 色谱条件

色谱柱：Agilent C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相A-流动相B（70：30）

流动相A：0.5mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸溶液调节pH值至3.5）-甲醇—水（10：30：60）；

流动相B：0.5mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸溶液调节pH值至3.5）-甲醇—水（10：50：40）；

流速：1.0ml/min；检测波长：225nm；柱温：30℃；进样量：20μl。

1.3 测量方法

供试品溶液的制备：取装量差异下的内容物，混匀，精密称取0.1g，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

对照品溶液的制备：精密称取青霉素对照品10mg，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

分取上述供试品溶液及对照品溶液20μl进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，其结果乘以1.0658，即为供试品中（C16H17N2NaO4S）的含量，测得结果按平均装量计算为96.2%。

2 不确定度的评定

2.1 数学模型

式中 Q-按平均装量计算注射用青霉素钠标示百分含量（%）；AX－供试品的峰面积；mR－对照品的称样量（mg）；VX－供试品的稀释体积（ml）；P-对照品的纯度（%）；供试品的平均装量（g）；AR-对照品的峰面积；mX－供试品的称样量（g）；VR－对照品的稀释体积（ml）；0.96－供试品的规格（g）；1.0658－转换因子；1000－由g转化为mg的换算系数。

2.2 不确定度的主要来源分析

（1）称量带来的不确定度，包括天平的最大允许误差、称量重复性。

（2）样品稀释带来的不确定度，包括：容量瓶的最大允许误差，体积测量的重复性，温度与体积校准时的温度差异。

（3）峰面积带来的不确定度，包括：峰面积的重复性，仪器等。

（4）对照品的纯度带来的不确定度。

（5）供试品的平均装量带来的不确定度，包括：装量差异，天平的重复性。

2.3 不确定度分量计算

2.3.1 供试品称样量的相对不确定度urel（mX）

（1）电子天平在d=0.1mg档，检定证书给出天平示值误差为0.3mg。按矩形分布，乘以转换因子b=0.6，u1（mX）=0.3mg×0.6=0.18mg

（2）电子天平在d=0.1mg档，检定证书给出天平重复性为0.3mg。按矩形分布，乘以转换因子b=0.6，u2（mX）

2.3.2 对照品称样量的相对不确定度urel（mR）

（1）电子天平在d=0.01mg档，检定证书给出天平示值误差为0.03 mg，按矩形分布，乘以转换因子b=0.6，u1（mR）=0.03mg×0.6=0.018mg

（2）电子天平在d=0.01mg档，检定证书给出天平重复性为0.04mg，按矩形分布，乘以转换因子=0.04mg×0.6=0.024mg

2.3.3 供试品平均装量的相对不确定度urel（）

取本品5瓶，分别精称内容物为：0.9678，0.9691，0.9760，0.9606，0.9558平均装量，按贝赛尔公式计算，

则urel（）=0.0035/0.9659=0.0036

2.3.4 供试品稀释体积的相对不确定度urel（VX）

（1）100ml 容量瓶为A级，最大允许误差为±0.10ml，按矩形分布，乘以转换因子b=0.6，u1（VX）=0.10 ml ×0.6=0.06 ml

（2）对100ml容量瓶重复测量10次，用贝塞尔公式计算得其标准偏差为0.021ml。则u2（VX）= 0.021ml

（3）本次试验温度为26℃，校准温度为20℃，按矩形分布，则u3（VX）= 100×6×2.1×10-4×0.6＝0.076ml。

2.3.5 对照品稀释体积的相对不确定度urel（VR） 同urel（VX）的评定

（1）10ml容量瓶（A级）的最大允许误差为±0.020ml，则u1（VR）=0.020 ml ×0.6=0.012 ml。

（2）读数的重复性标准偏差为0.015ml u2（VR）= 0.015ml

（3）温度 u3（VR）= 10×6×2.1×10-4×0.6＝0.0076ml。

2.3.6 供试品峰面积的相对不确定度urel（AX）

（1）两份样品平行进样两次，峰面积为6745947，6743720，6857776，6851480平均值分别为6744834，6854628采用极差法评定，R分别为2227、6296查表n=2时，得极差系数C=1.13，则s（AX）分别为1971、5572，则=4179A，u1rel（AX）=4179/6799731=0.00061。

（2）仪器检定证书给出的定量测量重复性为0.33%，按矩形分布，u2rel（AX）= 0.33%×0.6=0.0020。

2.3.7 对照品峰面积的相对不确定度urel（AR） 同urel（AX）的评定

两份对照品平行进样两次，峰面积为6760629，6766781，6579044，6570302，则u1（AR）=6989A，u1rel（AR）=6989/6669439=0.0010。

2.3.8 对照品的纯度的相对不确定度urel（P）

对照品的纯度为94.1%，未给出限度表示，其带来的不确定度在此可忽略不计。

2.3.9 供试品的规格0.96和转换因子1.0658均是给定数值，其带来的不确定度在此可忽略不计。

2.4 不确定度分量（见表2）

表2 各种不确定度分量汇总

2.5 合成不确定度及扩展不确定度计算

根据表2相对不确定分量合成后求得：

扩展不确定度的计算：取包含因子k =2，按平均装量计算，U=2×0.60%=1.2%

注射用青霉素钠含量测定结果：按平均装量计算，Q=（96.2±1.2）%（k=2）

3 讨论

（1）从本文可以看到，实验中样品的平均装量带入的不确定度是最大的，其次是对照品的称量。在工作中应随机取样，充分混匀样品等来减少取样过程所带来的不确定度分量。还可适当加大对照品的称量来减少由此带来的不确定度。

（2）玻璃量器带来的不确定度分量中，10ml容量瓶的不确定度大于100ml容量瓶，在含量测定中尽可能选用体积较大的玻璃量器。