烟草烟雾对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠发病的影响

谢建平 王赵伟 吴承龙 历莎

烟草烟雾是哮喘、慢性支气管炎等呼吸道慢性炎症疾病的危险因素。烟草烟雾进入气道后还能通过肺组织免疫活性细胞影响全身免疫功能状态[1-2]。中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病是一类自身免疫性疾病，遗传及环境因素与疾病的发生、发展密切相关。近期研究发现，烟草烟雾暴露是疾病的重要环境因素，但是研究证据尚不充分[3-4]。烟草烟雾室内污染在我国仍普遍存在，但对中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病的危害尚不明确也未引起重视[5]。实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是疾病动物模型。为探讨烟草烟雾暴露对EAE的影响，笔者在制作大鼠EAE模型后进行烟草烟雾暴露处理，观察大鼠行为学改变和星形胶质细胞形态变化，通过流式细胞术检测脾脏树突状细胞比例及细胞表型变化，初步探索相关免疫机制。

1 材料和方法

1.1 动物和试剂 清洁级8周龄SD大鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司；完全弗氏佐剂购自美国Sigma-Aldrich公司；卡介苗购自中国食品药品检定研究院；FITC标记的MHC-Ⅱ抗体、APC标记的CD11c/b抗体及PE标记的CD86抗体购自美国eBioscience公司；小鼠抗大鼠胶质纤维酸性蛋白（GFAP）一抗与小鼠IgG kappa结合蛋白偶联辣根过氧化物酶购自圣克鲁斯生物技术有限公司。FACSCantoⅡ流式细胞仪购自美国BD公司；某市售普通卷烟（每支含焦油11mg，烟碱1mg，一氧化碳11mg）。

1.2 动物分组及EAE模型制作 38只8周龄SD大鼠适应性饲养1周后分为3组，其中空白对照组6只，空气组与烟草烟雾组各16只。空气组与烟草烟雾组参考文献[6] 制作EAE模型：10%水合氯醛腹腔注射麻醉豚鼠，再用左心室灌注0.9%氯化钠溶液直到肝脏变白，再分离豚鼠脊髓，去除脊膜；加入等量无菌0.9%氯化钠溶液后4℃环境匀浆。新鲜配制的豚鼠脊髓匀浆液与完全弗氏佐剂（含卡介苗8mg/ml）等体积混合，用2个注射器链接后于0℃冰水中反复抽打，直到形成油包水乳剂。现配上述乳剂用1ml皮试用注射器皮下注射于大鼠四肢足垫（0.4ml/只）。空白对照组不建EAE模型，同期注射0.9%氯化钠溶液与完全弗氏佐剂混合的乳剂。空白对照组用于空气组与烟草烟雾组发病大鼠对照，比较发病大鼠的行为学变化以及星形胶质细胞的形态学变化。皮下注射乳剂当天记为第0天。

1.3 烟草烟雾暴露 在EAE造模后进行烟草烟雾暴露或压缩空气暴露。参考文献[7] 方法自制烟雾暴露系统，其中烟箱的容积为57.6dm2。烟草烟雾组在第1天到第20天每日8:00～11:00进行烟草烟雾暴露。烟草烟雾暴露时烟箱CO浓度维持在500mg/m3。空白对照组与空气组在第1天到第20天每日8:00～11:00进行压缩空气暴露。1.4 行为学评分 从EAE造模当天到大鼠被处死，按参考文献提供的标准[6]每天观察记录大鼠行为学评分。评分标准最高为5分，最低为0分。0分：无明显异常；1分：尾巴无力；2分：轻微后肢无力；3分：严重后肢麻痹；4分：四肢麻痹；5分：濒死或死亡。每天评分2次，均值为当日最终评分。从模型诱导到发病的时间段为潜伏期。整个观察期内行为学评分最大值定义为最高行为学评分。从EAE发病到观察期结束，每日行为学评分累积值定义为累积行为学评分。

1.5 星形胶质细胞形态学变化 采用免疫组织化学染色法。造模后第20天，采用10%水合氯醛麻醉大鼠后用无菌PBS灌注左心室的方法处死。分离脑脊髓组织后放入编号的容器内（含40g/L多聚甲醛）固定24h。再常规脱水、透明、浸蜡制成蜡块，切片、烤片后行免疫组化染色。其中染色步骤：石蜡切片脱蜡至水，高压锅加热进行抗原修复（含0.01M的柠檬酸缓冲液中），PBS洗涤3次；滴加 GFAP一抗（1:300）后 4℃过夜，PBS洗涤 3次；滴加 m-IgGκBP-HRP（1:100）孵育 120min，PBS 洗涤3次；滴加DAB工作液（注意在光镜下控制显色时间）；去离子水洗涤；梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。每张切片随机取3个视野观察阳性细胞形态、分布。

1.6 脾脏树突状细胞比例及细胞表型变化检测 分离脾脏后用注射器针头反复穿刺获得脾脏细胞；用红细胞裂解液处理15min；离心5min（500g）后用PBS重悬洗涤2次；细胞计数器计数并稀释到浓度为107/ml；用移液器吸取100μl于EP管，依次加入抗CD11c/b（树突状细胞标志物）、CD86和MCH-Ⅱ抗体，冰浴暗室孵育30min；PBS洗2次后上机检测（FACSCantoⅡ流式细胞仪）树突状细胞比例、CD86+树突状细胞比例和MHC-Ⅱ+树突状细胞比例。

1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。不符合正态的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用 Mann-WhitneyU检验；符合正态分布的计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 烟草烟雾组与空气组大鼠潜伏期、行为学评分比较 空白对照组未发病。空气组与烟草烟雾组大鼠在造模第9天左右开始发病，主要表现为进食及饮水量下降，行走时尾部上翘困难，步态拖沓。随着病情加重，出现肢体无力，多以下肢无力开始，逐渐发展到四肢无力，甚至濒死状态，但没有出现死亡。与空气组比较，烟草烟雾组潜伏期更短，最高行为学评分、观察期内累积行为学评分更高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 烟草烟雾组与空气组大鼠潜伏期、行为学评分比较

2.2 3组大鼠星形胶质细胞形态变化 免疫组化染色显示，相对于空白对照组，空气组与烟草烟雾组大鼠脑组织均存在星形胶质细胞增生，表现为细胞体积增大，突起粗大并且增多。相对于空气组，烟草烟雾组大鼠脑组织星形胶质细胞突起更为粗大，分布也更为广泛，见图1。

图1 3组大鼠星形胶质细胞形态变化（a：空白对照组；b：空气组；c：烟草烟雾组；免疫组化染色，×200）

2.3 烟草烟雾组与空气组大鼠脾脏树突状细胞表型的变化 烟草烟雾组与空气组大鼠脾脏树突状细胞比例和CD86+树突状细胞比例比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），但烟草烟雾组大鼠MHC-Ⅱ+树突状细胞比例高于空气组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2和图2。

表2 烟草烟雾组与空气组大鼠脾脏树突状细胞表型的变化（%）

图2 脾脏CD86+、MHC-Ⅱ+树突状细胞比例比较（a：空气组树突状细胞比例；b：烟草烟雾组树突状细胞比例；c：空气组CD86+、MHC-Ⅱ+树突状细胞比例；d：烟草烟雾组CD86+、MHC-Ⅱ+树突状细胞比例）

3 讨论

烟草烟雾对于健康的危害是多方面的，研究发现其是多发性硬化等中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病的重要危险因素[3,8]。通过SD大鼠EAE动物模型，笔者发现烟草烟雾组与空气组比较，发病潜伏期缩短，最高行为学评分与累积行为学评分均更高，差异均有统计学意义。可见在疾病的启动阶段到疾病发展阶段，烟草烟雾的吸入对EAE具有潜在的促发效应。进一步通过免疫组化染色发现星形胶质细胞在烟草烟雾暴露EAE大鼠中增生反应更加明显，表现为胞体变大，突起更为粗大，这提示星形胶质细胞参与了中枢炎症性反应，并可能与疾病的恶化存在潜在的关联。空白对照组大鼠星型胶质细胞与空气组及烟草烟雾组相比，细胞体积较小，突起也较为细小。且空白对照组均未出现行为学异常，结合上述两点，提示星型胶质细胞参与EAE中枢炎症性反应，其增值性反应可能是EAE炎症的标志物。

烟草烟雾的吸入包括主动吸烟与被动吸烟。流行病学研究发现多发性硬化患者主动抽烟人群生活质量下降及疾病恶化情况较未吸烟人群更为明显[9]，尽管主动抽烟与烟草烟雾被动吸入都可能加重此类疾病，但是目前机制还不明确[10-11]。

有研究发现烟草烟雾吸入可导致外周免疫调节性CD4CD25+T细胞比例下调，而IL-17+T细胞比例升高[12-13]，这种细胞免疫平衡紊乱可能是自身免疫性疾病发生、发展的关键环节。上述成熟的CD4+T细胞的发育与抗原递呈细胞的免疫表型有密切关系。树突状细胞就是最为常见的外周抗原递呈细胞，其免疫表型变化影响着幼稚T细胞的发育成熟。本研究发现，烟草烟雾组与空气组树突状细胞比例和CD86+树突状细胞比例比较差异均无统计学意义，但烟草烟雾组大鼠MHC-Ⅱ+树突状细胞比例高于空气组，差异有统计学意义。笔者推测烟草烟雾可能会影响树突状细胞MHC-Ⅱ表达上调，改变成熟CD4+T、CD8+T细胞表型以及功能，最终造成EAE发病过程中的细胞免疫功能紊乱。后续研究需要关注烟草烟雾对于树突状细胞、CD4+T、CD8+T细胞的分化与免疫功能的影响，以及与EAE中枢炎症启动、效应等阶段的关系。

综上所述，本研究初步发现烟草烟雾暴露与EAE病情恶化可能有关，并且伴随着过度增生的星形胶质细胞。烟草烟雾可能通过促进树突状细胞MHC-Ⅱ表达上调促进致病性淋巴细胞活化，造成EAE发病加重。