丹参多酚酸盐B对糖尿病大鼠认知功能及凋亡通路的影响

王金华 黄睿 张叶青 张丹红 柯博熙 陈富强

丹参多酚酸盐B是从丹参中提取的一种水溶性酚类化合物，在丹参中含量十分丰富[1]。在神经系统疾病的治疗方面，丹参多酚酸盐B主要应用于缺血性脑血管病的治疗，具有抗氧化应激、改善突触可塑性、抑制凋亡等重要作用[2]；丹参多酚酸盐B还具有改善血管性痴呆大鼠和Aβ沉积引起的痴呆鼠认知功能的作用[3-4]。另有研究证实丹参多酚酸盐B能通过调节血糖和脂类代谢有效治疗糖尿病和肥胖性疾病[5-6]。然而，丹参多酚酸盐B对糖尿病大鼠认知功能是否产生影响，相关研究报道较少。因此，本研究拟观察丹参多酚酸盐B对糖尿病大鼠认知功能的影响，并探讨其具体机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 选取雄性健康SPF级SD大鼠38只，由北京维通利华动物实验技术有限公司提供。每笼2～3只饲养，所有动物均可随意进食水。室内温度控制在21～25°C，动物房采用12h白天/黑夜循环周期的光照。所有实验程序均遵循神经科学研究关于哺乳动物的照料与使用规定。

1.2 主要试剂 丹参多酚酸盐B（120418）购于上海绿谷制药有限公司；B细胞淋巴瘤因子2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）（ab196495）、Bcl-2 相关 X 蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）（ab232479）、β-actin（ab179467）抗体均购于英国abcam公司。

1.3 分组和丹参多酚酸盐B药物注射 38只大鼠采用随机数字表法抽取10只作为对照组，常规饲养；剩下28只制作糖尿病大鼠模型。大鼠腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）60mg/kg（9g STZ 溶于 1L 0.9%柠檬酸盐缓冲剂，6.7ml/kg），注射后72h采集尾静脉血液，采用血糖仪检测血糖水平，血糖＞16.7mmol/L视为糖尿病模型制作成功。共有20只大鼠造模成功，再采用随机数字表法分为模型组和治疗组，每组10只。对照组大鼠给予柠檬酸盐缓冲剂（6.7ml/kg）。模型制作成功后1周，治疗组大鼠给予丹参多酚酸盐B 20mg/kg（3g丹参多酚酸盐B溶于1L 0.9%氯化钠溶液，6.7ml/kg）腹腔注射治疗，1次/d，连续6周。对照组和糖尿病组大鼠给予0.9%氯化钠注射液（6.7ml/kg）腹腔注射治疗，1次/d，连续6周。

1.4 血糖测定 实验开始及治疗结束时，取大鼠尾静脉血液，利用血糖仪测量各组大鼠血糖水平。

1.5 Morris水迷宫测试大鼠空间学习和记忆能力 丹参多酚酸盐B治疗结束后第2天进行Morris水迷宫检测。水迷宫水池桶直径1.5m、高0.5m，池内水深40cm，水温控制在21～24℃。隐性平台（直径10cm）位于水面下1cm处，放置在目标象限中央。前5d进行定位航行试验，每只大鼠面朝池壁放入水池中，记录逃避潜伏期，即大鼠登上水下平台的时间；第6天去除水下平台，进行空间搜索实验，记录大鼠跨台次数。

1.6 凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达水平检测 采用Western blot法。每组随机选取5只大鼠，5%水合氯醛腹腔注射麻醉，快速断头取脑，冰上分离海马组织。研磨海马组织后加入RIPA裂解液，离心后取上清液，采用BCA法检测蛋白浓度，10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，PVDF 膜转膜。TTBS 处理后与 Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000）一抗相结合，4°C 过夜。洗膜后与二抗相结合并孵育。利用凝胶成像系统显影成像。采用Image Lab配套软件分析系统对条带进行半定量分析。蛋白相对表达量=目的蛋白光密度值（IOD）/内参IOD值。

1.7 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠治疗前后血糖水平比较 3组大鼠实验开始前血糖水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后，与对照组比较，糖尿病组和治疗组大鼠血糖水平均升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与糖尿病组比较，治疗组大鼠血糖水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 1。

表1 3组大鼠治疗前后血糖水平比较（mmol/L）

2.2 3组大鼠逃避潜伏期和跨台次数比较 与对照组比较，糖尿病组和治疗组大鼠逃避潜伏期均延长，跨台次数均减少，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与糖尿病组比较，治疗组大鼠逃避潜伏期缩短，跨台次数增多，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2 3组大鼠逃避潜伏期和跨台次数比较

2.3 3组大鼠海马组织凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达水平比较 与对照组比较，糖尿病组和治疗组大鼠Bax表达水平均升高，Bcl-2表达水平均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与糖尿病组比较，治疗组大鼠Bax表达水平降低，Bcl-2表达水平升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表 3。

3 讨论

糖尿病是世界上最常见的代谢紊乱性疾病，发病率呈逐年上升趋势。2015年全世界大约有4.15亿人患有糖尿病，到2040年，这个数字将达到6.42亿[7]。糖尿病被公认为是影响认知功能障碍发展的独立危险因素[8]。本研究证明STZ诱导的糖尿病模型大鼠出现了学习记忆的损伤，但经丹参多酚酸盐B治疗后，糖尿病大鼠的空间学习记忆能力明显改善。

表3 3组大鼠海马组织凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达水平比较

丹参多酚酸盐B是一种重要的生物活性化合物，它是从中国传统药用植物丹参中提取的，具有抗炎、抗氧化和神经保护作用[9-10]。研究表明丹参多酚酸盐B能够维持神经干细胞/祖细胞的自我更新和增殖，从而保护神经元不受细胞凋亡的影响并减轻由短暂性脑缺血引起的学习和记忆障碍[11]。先前研究已表明，丹参多酚酸盐B具有很强的抗氧化活性[12]，如防止脂质过氧化反应，抑制丙二醛形成，以及降低血管内皮细胞炎症因子介导的细胞膜渗透性[13]。然而丹参多酚酸盐B对于糖尿病相关认知功能障碍的作用机制的研究较少报道。

糖尿病导致认知功能障碍的机制仍不是十分明确。据报道，大鼠的慢性高血糖会导致大脑皮层神经元的显著丧失，这可能会损害认知能力。动物研究表明，由STZ引起的慢性高血糖降低了大鼠脑中乙酰胆碱的合成和释放，对于认知功能同样造成影响[14]。本实验发现丹参多酚酸盐B治疗后糖尿病大鼠的血糖水平明显降低，这可能是其改善糖尿病大鼠认知功能的作用机制之一。细胞凋亡在神经系统发育和包括阿尔茨海默病在内的许多慢性神经退行性疾病的发展过程中起着至关重要的作用。有研究表明，凋亡的发生同样是糖尿病相关认知功能障碍的重要生物学机制[15]。线粒体内在凋亡过程发生在线粒体中，主要涉及到Bcl-2家族和Caspase家族。Bcl-2家族主要包括抗凋亡蛋白（如Bax）和促凋亡蛋白（如Bcl-2）。学习和记忆能力与许多大脑结构密切相关，如海马区，因此本研究检测了海马区凋亡相关蛋白的表达情况。本研究发现糖尿病大鼠海马组织Bax表达水平升高，Bcl-2表达水平降低，应用丹参多酚酸盐B治疗后海马组织Bax表达水平降低，Bcl-2表达水平升高，提示丹参多酚酸盐B明显抑制了糖尿病大鼠海马组织凋亡的发生，这可能是其改善糖尿病大鼠认知功能的重要机制。

综上所述，丹参多酚酸盐B治疗可明显改善糖尿病大鼠认知功能，其作用机制可能与提高Bax的表达并降低Bcl-2的表达，从而抑制凋亡通路密切相关。