表没食子儿茶素没食子酸酯对脊髓损伤后小鼠神经功能的恢复作用及机制研究

吴凯 封志云 胡小坚

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是中枢神经系统严重的损伤，常导致损伤平面以下感觉、运动功能障碍，致残率高，给个人、家庭及社会带来了巨大的负担。目前，对于SCI仍无有效的治疗方法。表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是绿茶中提取的多酚的活性成分，能清除氧自由基，易透过血脑屏障，是重要的天然抗氧化剂。研究表明，EGCG具有抗肿瘤、抗细胞凋亡、抗炎等多种生物学效应[1-3]。同时，大量研究证实EGCG对于神经细胞具有保护作用[4-5]，但其机制仍不明确。本研究采用挤压型方法制作小鼠急性SCI动物模型，术后通过小鼠BMS评分评价EGCG对SCI后小鼠神经功能的恢复作用，并观察脊髓组织细胞形态变化，检测Cleaved Caspase-3、B细胞淋巴瘤因子2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）蛋白表达水平，以探讨其潜在机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 选取雌性健康SPF级C57BL/6小鼠35只，体重18～24g，购于上海实验动物中心，于浙江大学实验动物中心分笼饲养，每笼5只。动物饲养在屏障环境内，室温控制在20～25℃，给予动物12h光照/12h黑暗交替的环境。所有动物自由摄食摄水。操作均严格遵守《实验动物管理条例》的相关规定。

1.2 主要器材和试剂 血管夹（15g）购自上海医疗器械有限公司，EGCG（E4143，50mg）购自美国 Sigma-Aldrich公司，Cleaved Caspase-3抗体（9661）和 Bax抗体（14796）购自美国Cell Signalling Technology公司、Bcl-2抗体（ab182858）购自美国Abcam公司。

1.3 小鼠急性SCI动物模型建立及分组 采用挤压型方法制作小鼠急性SCI动物模型，具体操作如下：用1%戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔内注射麻醉小鼠，俯卧位固定，常规备皮、消毒、铺巾。在T8～10水平作背部正中切口，充分暴露并切除T8～10棘突及椎板，充分暴露脊髓T9节段，用15g力度的血管夹夹住T9段脊髓1min，夹闭1min后放开血管夹。止血后逐层缝合切口。制作SCI小鼠25只，为保证模型统一标准，造模后进行行为学检测，选取行为学评分≤1分的小鼠20只（剔除行为学评分＞1分的小鼠5只）。采用随机数字表法将造模成功的20只小鼠分为EGCG组和SCI组，每组10只。另10只未造模的小鼠仅行椎板切除，作为假手术组。EGCG组小鼠于造模后给予EGCG（50mg/kg，50mg溶于10ml 0.9%氯化钠注射液，10ml/kg）腹腔注射，1次/d，连续 7d。假手术组和SCI组小鼠给予0.9%氯化钠注射液（10ml/kg）腹腔注射，1 次/d，连续 7d。

1.4 行为学评分 根据文献报道[6]，将小鼠后肢运动功能分为10个等级，完全正常行走为9分，后肢完全瘫痪为0分。分别于术后第1、3、5、7天进行小鼠BMS评分，将动物置于宽阔活动场地自由活动5min，观察其后肢运动情况，左右两侧肢体分别评分，取平均值为每只大鼠的功能得分。由不参与动物分组与治疗但熟悉评分标准的2位观察者同时独立进行评分，取平均值。

1.5 脊髓组织细胞形态变化观察 术后第7天，每组取6只小鼠进行病理学观察，腹腔注射过量戊巴比妥钠深度麻醉小鼠，经左心室灌注0.9%氯化钠注射液至流出澄清液，再用4%多聚甲醛心脏灌注固定后，以损伤中心区为中点取1cm左右脊髓组织样本，PBS清洗后置于4%多聚甲醛中固定，再行脱水、包埋、切片等步骤，行HE染色，镜下观察各组脊髓瘢痕和空洞面积，评价脊髓损伤程度。

1.6 脊髓组织Cleaved Caspase-3表达水平检测 采用免疫组化法。上述小鼠每只取5张距损伤中心或相应部位0.5cm内的切片，常规脱蜡，3%过氧化氢处理、高温修复、血清封闭、一抗 4℃过夜（浓度为 1∶150），同时用PBS代替一抗作为阴性对照，隔日滴加二抗，室温孵育30min，继而二氨基联苯胺（DAB）显色，甘油封片后，倒置显微镜下观察切片阳性表达（棕色）的部位及强弱程度，用Image-Pro Plus 6.0软性行平均光密度分析。以上各步骤间均用PBS充分漂洗3次，5min/次。

1.7 脊髓组织Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达水平检测 采用Western blot法。术后第7天，每组取4只小鼠腹腔注射过量戊巴比妥钠处死，直视下取出包含损伤部位在内的1cm脊髓组织，获取脊髓蛋白，根据蛋白浓度进行等量上样，电泳，转印，5%脱脂奶粉封闭，4℃一抗 Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2 孵育过夜，洗膜，室温下荧光二抗孵育1h，充分洗膜，ECL试剂发光，暗室曝光显影。凝胶成像分析系统上摄像分析，并定量分析条带灰度。

1.8 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组小鼠BMS评分比较 SCI后，小鼠双后肢均全瘫。与假手术组比较，术后各时点SCI组和EGCG组小鼠BMS评分均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与 SCI组比较，术后第 3、5、7 天 EGCG 组小鼠BMS评分均升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 3组小鼠BMS评分比较（分）

2.2 小鼠脊髓组织病理检查结果 HE染色结果显示假手术组小鼠脊髓组织结构完整，神经细胞分布均匀；SCI组小鼠脊髓组织中神经细胞核仁模糊，细胞肿胀，周围间隙增大，出现大量坏死细胞，形成大量空泡，炎性细胞浸润程度高；EGCG组小鼠坏死神经细胞较SCI组有所减少，空泡数量减少，炎性细胞浸润程度低，见图1。

图1 小鼠脊髓组织病理切片所见（a：假手术组；b：SCI组；C：EGCG组；HE染色，×20）

2.3 3组小鼠脊髓组织Cleaved Caspase-3表达水平比较 术后第7天，与假手术组比较，SCI组和EGCG组小鼠脊髓组织Cleaved Caspase-3的表达明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与SCI组比较，EGCG组小鼠脊髓组织Cleaved Caspase-3的表达有所降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2-3。

图2 3组小鼠脊髓组织Cleaved Caspase-3免疫组化染色结果（a：假手术组小鼠Cleaved Caspase-3无明显阳性表达；b：SCI组小鼠可见大部分细胞表达强阳性；C：EGCG组小鼠可见部分细胞表达阳性；免疫组化染色，×40）

图3 3组小鼠脊髓组织Cleaved Caspase-3表达的平均光密度值比较（与假手术组比较，*P＜0.05；与 SCI组比较，△P＜0.05）

2.4 3组小鼠脊髓组织凋亡相关蛋白表达水平比较 术后第7天，与假手术组比较，SCI组和EGCG组小鼠脊髓组织Cleaved Caspase-3及Bax蛋白表达水平均升高，Bcl-2蛋白表达水平降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与SCI组比较，EGCG组小鼠脊髓组织Cleaved Caspase-3及Bax蛋白表达水平均降低，Bcl-2蛋白表达水平升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图4。

图4 3组小鼠脊髓组织凋亡相关蛋白表达水平比较（a：3组小鼠脊髓组织凋亡相关蛋白表达的电泳图；b：3组小鼠脊髓组织Cleaved Caspase-3蛋白表达水平比较；c：3组小鼠脊髓组织Bax蛋白表达水平比较；d：3组小鼠脊髓组织Bcl-2蛋白表达水平比较；与假手术组比较，*P＜0.05；与 SCI组比较，△P＜0.05）

3 讨论

本研究发现，经EGCG治疗后，SCI小鼠的BMS评分明显升高，提示EGCG可明显改善SCI小鼠神经功能的恢复。SCI可分为原发性损伤和继发性损伤，原发性损伤发生在损伤当时，其结果是不可逆的，而继发性损伤则是损伤后发生的一系列复杂的分子生物学反应引起的神经元可逆性损伤，因此，有效抑制继发性损伤是治疗SCI的重点。脊髓继发性损伤的过程十分复杂，其机制包括缺血缺氧[7]、脂质过氧化[8]、细胞内钙离子超载[9]、兴奋性氨基酸毒性[10]、神经细胞凋亡[11]等。其中，神经细胞凋亡是继发性损伤的重要病理基础，因此，抑制神经细胞凋亡可有效减少继发性损伤，促进神经功能恢复。

细胞凋亡是受一系列连续基因调控的程序化反应，通常可以分为死亡受体（外源性）和线粒体（内源性）两条途径。在凋亡过程中，Bcl-2家族蛋白起重要调控作用，主要参与细胞的内源性凋亡途径完成对细胞凋亡的调控。Bcl-2家族可以分为两类：一类是抗凋亡基因，代表基因是Bcl-2基因；另一类是促凋亡基因，代表基因是Bax基因。而Caspase-3是细胞凋亡蛋白级联反应的必经之路，当细胞发生凋亡时，Caspase-3被活化成Cleaved Caspase-3，它的活化是凋亡进入不可逆阶段的标志[12-14]。EGCG是从绿茶中提取的多酚的活性成分，研究表明，EGCG具有很强的抗氧化活性，可抑制各种诱因导致的细胞凋亡，对细胞具有保护作用。Shi等[15]研究发现，EGCG可以通过激活NRF2/HO-1通路来抑制微囊藻毒素诱导的人脐静脉血管内皮细胞的凋亡；Yan等[16]研究发现，EGCG可以通过抑制氧化应激来抑制H2O2诱导的血管平滑肌细胞的凋亡；Du等[17]研究发现，EGCG可以通过抑制内质网应激介导的细胞凋亡来减少阿尔兹海默病中的神经毒性。本实验观察到，SCI小鼠Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平均升高，Bcl-2蛋白表达水平降低，EGCG治疗后，小鼠Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平均降低，Bcl-2蛋白表达水平升高，提示EGCG对SCI小鼠有明显的抗凋亡作用。

综上所述，EGCG治疗可明显促进SCI小鼠神经功能的恢复，其对小鼠发挥神经保护作用的机制可能与抑制神经细胞凋亡密切相关。本研究结果证实了EGCG治疗对SCI小鼠的保护作用，这为SCI的基础和临床治疗提供了一定的理论基础。然而，这一作用具体的分子机制还需进一步的研究去揭示。