壳寡糖与屎肠球菌对肉仔鸡生长性能、免疫功能及肠道短链脂肪酸含量的影响

2019-08-12安文艺雷佳琦董元洋邵玉新张炳坤

中国畜牧杂志 2019年8期

安文艺，雷佳琦，董元洋，武威，刘璇，邵玉新，张炳坤

（中国农业大学动物科学技术学院，动物营养学国家重点实验室，北京100193）

肉仔鸡生长快，饲养集约化程度高、密度大，致其免疫力低下，抗病力差，易受到各种病原菌侵袭。抗生素在改善畜禽免疫力和生产性能方面做出重要贡献[1]，但抗生素在畜禽饲料中的禁用势在必行，寻找抗生素替代物以改善畜禽免疫力成为当今畜牧业关注的热点。壳寡糖（Chitooligosaccharides, COS）是目前发现的自然界中唯一碱性功能寡糖，有来源广、分子量小、活性高等优点，在调节肠道微生物区系、提高机体免疫力和改善动物生长性能方面均有显著效果。研究显示，COS可提高肉仔鸡胸腺指数和法氏囊指数，降低肠道中大肠杆菌数，促进肉仔鸡生长[2-3]。屎肠球菌（Enterococcus faeciums，PNC）是人和动物肠道菌群组成成员，可代谢产生有机酸、过氧化氢和细菌素等，降低肠道pH，抑制病原菌，有益生特性[4]。研究表明，PNC 可促进肉鸡生长，缓解大肠杆菌和沙门氏菌导致的肉仔鸡生产性能下降，并提高血清中IgA 含量，增加盲肠生物多样性，改善肠道微生物组成[5-6]。

脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的重要组分，是免疫系统的有效激活剂，广泛应用于炎症反应模型构建。研究表明，LPS 刺激降低肉仔鸡生长性能，诱发全身炎症反应，导致IL-1β 等表达量上升[7-8]，COS 抑制LPS 刺激的RAW 264.7 细胞中促炎介质如IL-1β 和NO 产生[9]。目前，关于COS 与PNC 联合使用的报道较少，但已发现COS 可促进益生菌增殖[10]，二者同时添加或能更好地发挥益生作用。因此，本试验用LPS 构建炎症反应模型，多次注射模拟细菌感染，探究COS 与PNC 对LPS 诱导炎症反应的作用效果，为其在肉鸡饲粮中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 COS 为寡糖素COS（II），化学名称为寡聚β-(1-4)-2- 氨基-2- 脱氧-D- 葡萄糖，聚合度2～10。寡糖素COS（II）（以下简称COS）产品是以甲壳类动物多糖为原料，采取酶法降解壳聚糖与膜分离结合技术生产的一种吸收性寡糖，含COS10%，载体为麦芽糊精。

PNC 为实验室保藏鸡源屎肠球菌PNC01[11]，将保藏菌种用MRS 培养基培养3 代后，发酵、喷粉，以稻壳为载体，有效含量为5×1010CFU/g。

1.2 试验动物及日粮选取1 日龄健康且体重相近的AA公雏560 羽，采用2（LPS 刺激/非LPS 刺激）×2（添加COS/不添加COS）×2（添加PNC/不添加PNC）三因素试验设计，共8 个处理，每处理7 重复，每重复10只鸡（各笼鸡平均体重为鸡群平均体重±3%），试验期21 d。试验饲粮参照《鸡营养需要》（NY/T 33-2004），结合《AA 肉鸡饲养管理手册》配制，呈粉状，基础日粮组成和营养成分见表1。采用玉米-豆粕型基础饲粮，试验饲粮分别在基础日粮基础上添加COS（200 mg/kg）和PNC（1×109CFU/kg）。

表1 基础日粮组成和营养成分（风干基础）

1.3 LPS 刺激与饲养管理试验用LPS 为大肠杆菌源脂多糖，购自Sigma-Aldrich（美国），于试验鸡17、19和21 日龄早晨每只鸡腹腔注射1 mg/kg BW 的LPS，对照组腹腔注射生理盐水。

动物饲养试验于中国农业大学家禽试验基地进行，肉仔鸡3 层笼养，自由采食和饮水，常规免疫。每天观察温度、湿度变化和采食情况，记录死亡情况。

1.4 样品采集与指标测定于试验鸡21 日龄，每重复随机选取1 只健康且接近平均体重的鸡，于腹腔注射LPS 3 h 后，称活重，翅静脉无菌采血，颈静脉放血致死，分离肝脏、脾脏、法氏囊和胸腺后称重。取脾脏和回肠组织样于2 mL RNAase free 管中，液氮速冻，-80℃保存待测。取盲肠食糜于5 mL 离心管，-80℃保存，测定短链脂肪酸（SCFA）含量。

1.4.1 生长性能试验开始，第17 天和21 天早晨以重复为单位称取空腹重，用于生长性能的统计。计算阶段采食量、体增重和耗料增重比（采食量/体增重）。

1.4.2 器官指数根据肝脏、脾脏、法氏囊和胸腺的重量和鸡只活重，计算器官指数：器官指数=器官重（g）/宰前活重（kg）。

1.4.3 肠道组织形态回肠组织样品经10%中性甲醛固定后，用石蜡包埋，制作石蜡切片，PAS 染色后进行肠道形态的观测。用活细胞工作站进行绒毛高度和隐窝深度的测定。每个切片选取10 根完整且平直的绒毛和对应的10 个隐窝深度，绒毛高度为绒毛顶端到隐窝入口处的垂直距离，隐窝深度为隐窝入口到绒毛基部的垂直距离。

1.4.4 血清中IgA 含量测定翅静脉无菌采血2 mL，4℃，3 000 r/min 离心15 min，分离所得血清-20℃保存待测。用双抗夹心ELISA 法测定血清中IgA，试剂盒购自美国Bethyl 公司，测定方法参照说明书，血清稀释8 000 倍测定，用ELISA calc 软件绘制标准曲线。

1.4.5 脾脏和回肠mRNA 表达量测定总RNA 采用RNAiso Plus 试剂（TaKaRa，日本）提取，步骤参见Wang 等[8]。RNA 浓度和纯度采用Nanodrop 2000 测定，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检查其完整性，浓度、纯度和完整性均符合要求的RNA 进行反转录。反转录采用PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂（TaKaRa，日本）。操作按照试剂盒说明书进行，取910 ng RNA 反转录为cDNA，-30 ℃保存备用。qPCR 在7500 荧光定量PCR 仪（Applied Biosystems，Foster City， California， USA）上进行，试剂为SYBR®Premix Ex Taq™（TaKaRa，日本）。PCR反应条件参考试剂盒说明书。反应结束后用熔解曲线和琼脂糖凝胶电泳检测表达产物的特异性。用2-ΔΔCt计算相对表达量，目的基因及内参基因的引物序列见表2。

1.4.6 盲肠食糜中SCFA 含量的测定取盲肠冻存样品，用剪刀剪开肠壁取0.1 g 左右于10 mL 离心管，加入5 mL盐酸甲酸混合液，200 µg 内标溶液，钢珠2 颗，迅速放回；置于冰上1 h，并间歇震荡混匀；14 000 r/min离心20 min；用2 mL 注射器吸取1 mL 左右离心上清液，通过0.2 µm 的滤膜过滤至2 mL 样品瓶中。用气象色谱（SCION-456-GC）检测，使用氮气作为载气，流速为20 mL/min，氢气流量为30 mL/min，空气流量为300 mL/min。将检测器和注射器温度分别加热至230℃和200℃，进样量为2 μL，测定乙酸、丙酸和丁酸含量。结果表示为每克食糜样品中SCFA 的微克数（μg/g）。

表2 Real-time PCR 引物序列

1.5 统计分析数据经Excel 2007 处理后，采用SPSS 18.0 一般线性模型（GLM）分析；当LPS 刺激、COS与PNC 处理的交互作用显著时，做单因素方差分析，当组间差异显著时，采用Duncan's 结合LSD 多重比较进行分析，P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。试验结果用平均值和SEM（标准误）表示。

2 结果

2.1 COS 和PNC 对肉仔鸡生长性能的影响由表3 可知，各处理组肉仔鸡0～17 d 的生长性能无显著差异。由表4 可知，LPS 刺激降低了肉仔鸡17～21 d 采食量（P＜0.01），有提高耗料增重比的趋势，对体增重及0～21 d 生长性能无显著影响。添加COS 可缓解LPS 刺激下的采食量下降（P＜0.05），提高0～21 d 肉仔鸡体增重（P＜0.05），有提高0～21 d 采食量并降低耗料增重比的趋势。COS 与PNC 对0～21 d 肉仔鸡的体增重和采食量交互作用显著（P＜0.05）：在非LPS 刺激条件下，同时添加COS 和PNC 较单独添加PNC 可提高肉仔鸡体增重和采食量（P＜0.05），但刺激条件下各日粮处理组差异不显著。LPS、COS 和PNC 三因素互作对生产性能无显著影响。

2.2 COS 和PNC 对肉仔鸡器官指数的影响由表5 可知，LPS 刺激提高21 d 肉仔鸡肝脏和脾脏指数（P＜0.01），对胸腺指数无显著影响。COS 可降低21 d 肉仔鸡脾脏指数（P＜0.05），PNC 可降低21 d 肉仔鸡脾脏指数（P＜0.01）。LPS、COS 和PNC 三因素互作对法氏囊指数有显著差异（P＜0.05），LPS 刺激降低肉仔鸡法氏囊指数（P＜0.05），单独或同时添加COS 和PNC 均能缓解法氏囊指数降低。

表3 COS 和PNC 对LPS 刺激前（0～17 d）肉仔鸡生长性能的影响

表4 COS 和PNC 对LPS 刺激后（17～21 d）和全期（0～21 d）肉仔鸡生长性能的影响

2.3 COS 和PNC 对肉仔鸡肠道形态的影响由表6 可知，LPS 刺激降低21 d 肉仔鸡回肠绒毛高度和隐窝深度（P＜0.01），对绒毛高度/ 隐窝深度无显著影响；PNC 降低21 d 肉仔鸡回肠隐窝深度（P＜0.05），对绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度无显著影响；COS 及各因素互作对肠道形态无显著影响。

表5 饲粮中添加COS 和PNC 对肉仔鸡免疫器官指数的影响 g/kg BW

2.4 COS 和PNC 对肉仔鸡血清IgA 含量的影响由表7可知，LPS 刺激降低21 d 肉仔鸡血清IgA 含量（P＜0.05），COS 降低21 d 肉仔鸡血清IgA 含量（P＜0.05），PNC可提高21 d 肉仔鸡血清IgA 含量（P＜0.05），各因素互作对血清IgA 含量无显著影响。

2.5 COS 和PNC 对肉仔鸡脾脏和回肠mRNA 相对表达量的影响由表8 可知，LPS 刺激提高肉仔鸡脾脏和回肠IL-1β 和脾脏IL-8 mRNA 表达量（P＜0.01），降低脾脏TLR4 mRNA 表达量（P＜0.01），对NF-κB mRNA 表达量无显著影响；COS 有降低脾脏IL-1β 表达量的趋势（P=0.097），降低LPS 刺激后IL-8 mRNA表达量（P＜0.05）。PNC 及各因素互作对各基因表达量无显著影响。

表6 饲粮中添加COS 和PNC 对肉仔鸡回肠形态的影响

2.6 COS 和PNC 对肉仔鸡盲肠SCFA 含量的影响由表9 可知，LPS 刺激降低21 d 肉仔鸡盲肠食糜中丁酸含量（P＜0.05），对盲肠食糜中乙酸和丙酸含量无显著影响。COS 提高盲肠食糜中丙酸和丁酸含量（P＜0.05），有提高乙酸含量的趋势。LPS 和PNC 对盲肠食糜中乙酸含量交互作用显著（P＜0.05）；非LPS 刺激条件下，同时添加COS 和PNC 增加盲肠食糜中乙酸含量（P＜0.05），LPS 刺激条件下，添加PNC 降低盲肠食糜中乙酸含量（P＜0.05）。各因素互作对丙酸和丁酸含量无显著交互作用。

3 讨论

3.1 COS 和PNC 对肉仔鸡生长性能的影响益生菌与益生元是重要的抗生素替代物。前人研究表明，COS单独添加及与干酪乳杆菌共同添加可显著提高肉仔鸡的平均日增重[12]。COS 的免疫调节效果以及鸡源PNC的促生长效果均已经被证实[9,11]，但同时添加COS 和PNC 的免疫调节功能有待探究。本试验通过LPS 多次刺激肉仔鸡，建立肉仔鸡炎症反应模型，以探究COS和PNC 的免疫调节作用。LPS 刺激导致免疫应激，研究表明，LPS 刺激提高肉鸡肝脏的相对重量，降低体重和饲料利用率，还可影响骨骼代谢，降低胫骨重量与胫骨强度，增加骨骼的分解代谢，改变机体组成成分[13]；另外，LPS 刺激还会消耗营养物质用于细胞因子等分泌，造成分解代谢增强，合成代谢减弱[14]。本试验发现，LPS 刺激降低肉仔鸡17～21 d 采食量，COS 可以提高应激状态下的采食量，改善体增重，降低了LPS 对肉仔鸡生长的不良影响。

表7 饲粮中添加COS 和PNC 对肉仔鸡血清IgA 的影响

3.2 COS 和PNC 对肉仔鸡器官指数的影响肝脏是急性期蛋白合成的场所，脾脏则是机体重要的外周免疫器官，是免疫感应发生的重要场所，二者相对指数增加有利于提高抗原清除速度。研究发现，LPS 多次刺激显著提高肉仔鸡肝脏和脾脏的器官指数[7]。本试验发现添加COS 和PNC 可抑制LPS 刺激后脾脏指数上升。法氏囊则是禽类特有的中枢免疫器官，可产生B 淋巴细胞，从而产生特异性抗体完成特定免疫应答。本试验发现，COS 可缓解LPS 刺激后法氏囊萎缩，这与Deng 等[15]发现的COS 促进法氏囊发育的报道相一致。

表8 饲粮中添加COS 和PNC 对肉仔鸡脾脏mRNA 表达量的影响

3.3 COS 和PNC 对肉仔鸡肠道组织形态的影响肉仔鸡生长早期，持续的LPS 刺激会降低肠道的生长速度和肠道上皮细胞的增殖速度，进而降低肉仔鸡十二指肠和空肠的绒毛高度和隐窝深度，进而降低肠道的吸收能力[16]。本试验中LPS 刺激后肉仔鸡回肠形态被破坏，肉仔鸡生长性能下降。一般来说，回肠更接近后肠段，pH 更高，食糜流通速度慢，更易受到微生物影响，进而通过改变SCFA 含量，尤其是丁酸含量来改变肠道形态，然而本试验条件下COS 和PNC 没有显著改善LPS 造成的肠道形态改变。

3.4 COS 和PNC 对肉仔鸡血清IgA 含量的影响 IgA是在体液免疫应答中发挥重要作用的免疫分子，也是外分泌液中主要的免疫球蛋白，具有抗菌、抗病毒和抗毒素作用，而应激反应会导致IgA 水平的波动。Huang 等[17]研究发现，添加COS 可提高肉鸡血清中IgA 水平，与本试验结果有差异，这可能与添加水平和壳寡糖组分有关。据报道，PNC 可提高肉仔鸡血清中IgA 水平[6]，与本试验结果一致，表明添加PNC 可提高肉仔鸡体液免疫水平，这可能与其对肉仔鸡肠道微生物区系的改善有关，也可能是PNC 作为抗原通过树突细胞和巨噬细胞等上调了机体体液免疫水平。

表9 饲粮中添加COS 和PNC 对肉仔鸡盲肠食糜中SCFA 含量的影响 μg/g

3.5 壳寡糖和PNC 对肉仔鸡脾脏和回肠mRNA 相对表达量的影响 Takahashi 等[18]研究发现，LPS 刺激后2～4 h，脾脏中炎症相关因子IL-1β mRNA 相对表达量先升高后降低，且在刺激后3 h 达到峰值，而脾脏TLR4 的表达量在刺激后4 h 内持续下降，与本试验结果一致。IL-1β 是重要的促炎细胞因子，IL-8 是重要的趋化因子，可以募集异噬细胞，用于抗原清除，COS 降低IL-1β 和IL-8 表达可能有利于抑制过度的炎症反应，避免机体损伤。研究证实，COS 抑制LPS 与TLR4/MD-2 受体复合物结合，快速磷酸化ERK、JNK和p38，降低MAPK 的活化，减少NF-κB 核易位，最终使LPS 刺激的RAW 264.7 细胞中促炎介质（如IL-1β、NO 等）产生减少[9]。Lin 等[19]在研究COS 对血管内皮细胞的抗炎作用时得到了相似结果。本试验结果发现，壳寡糖降低IL-1β 基因表达，却未见对NF-κB表达量的显著影响，其具体机制仍需探究；而LPS 多次刺激降低TLR4 基因表达，这可能是LPS 多次刺激引起了免疫耐受，炎症反应弱化[7]。

3.6 壳寡糖和PNC 对肉仔鸡盲肠SCFAs 含量的影响免疫应激影响肠道微生物区系[20]。肠道中SCFA 主要由微生物发酵未消化的碳水化合物产生，肠道微生物区系影响SCFA 含量及组成。本研究显示，LPS 刺激后盲肠丁酸含量显著降低，可能是由于LPS 刺激扰乱了肠道微生物区系，使发酵产生SCFA 的厌氧菌含量下降，从而降低了盲肠SCFA 含量。丁酸可抑制IκB 降解，降低NF-κB 表达，从而抑制IL-1β 产生，这可能是LPS刺激后IL-1β 表达增加的原因之一。COS 显著提高盲肠食糜中丙酸和丁酸含量，丁酸和丙酸在不同生理浓度共同存在情况下，其生物学作用十分复杂，丁酸对基因表达影响最大，丙酸次之[21]。丁酸盐抑制NF-κB 的核转录及与DNA 的结合，或诱导IκB-β 高表达抑制NF-κB表达，抑制NF-κB 信号通路的激活，缓解炎症反应[22]，这可能是COS 抑制炎症反应发生的途径之一，但目前缺乏家禽上SCFAs 受体的报道，因此关于其相互作用机制还有待进一步探究。