日粮不同锌源及锌水平对肉鸡免疫调节作用的研究

高金鑫，张贝贝，唐大智，甘利平，闫少佳，李 光，呙于明

（中国农业大学动物科学技术学院，动物营养学国家重点实验室，北京 100193）

锌是一种与肉鸡健康、疾病关系密切的重要金属元素，参与众多重要生理生化过程。锌在细胞呼吸作用、免疫功能、抗氧化、蛋白合成、伤口愈合、DNA 合成及细胞分裂等方面发挥关键作用，而锌营养的不足或过度吸收也会导致很多疾病。研究发现，锌缺乏对免疫系统的影响尤为严重。De Pasquale 等[1]研究表明，锌缺乏可使小鼠的胸腺相对重量减轻，且这种变化随着低锌饲粮饲喂周期的延长而加剧。Mohhamdi 等[2]研究发现，相对于空白对照组，日粮中添加纳米硫酸锌和纳米蛋氨酸锌后肉鸡抗体滴度、脾脏和法氏囊指数均显著上升。Peterson 等[3]研究发现，轻微缺锌可加剧脂多糖（LPS）诱导的小鼠空肠白细胞入侵，同时提高了血浆中白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-10（IL-10）水平。Levkut 等[4]研究发现，日粮中添加30、70 mg/kg 硫酸锌和30 mg/kg 甘氨酸锌可提高肉仔鸡空肠分泌型免疫球蛋白A（sIgA），且饲喂低锌日粮对维持肠道免疫稳态更有益处。Nagalakshmi 等[5]研究显示，与无机锌相比，饲喂不同来源的有机锌可提高大鼠抗氧化酶的活性、加强免疫应答，并提高血清孕酮水平。Zhang 等[6-7]研究表明，在基础日粮中添加锌（80 mg/kg 硫酸锌和20、40、60、80 mg/kg 甘氨酸锌）可改善肉种鸡的生产性能、繁殖机能，提高锌沉积量及抗氧化能力，其中添加80 mg/kg 甘氨酸锌的效果最佳。

目前，有关不同化合物锌源在促进动物生长、维持生化代谢有关酶活性、组织中锌沉积等方面的相对生物效价的研究较多，但极少有调节免疫炎症反应方面的研究报道。本研究设置不同水平的硫酸锌和甘氨酸锌日粮，检测外周血淋巴细胞转化率、脾脏和空肠mRNA 相对表达量等，研究不同化合物锌源对正常生理条件及LPS攻毒感染条件下肉仔鸡免疫的调节作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料 LPS Escherichia coli O55:B5 购于西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；甘氨酸锌（22%）和硫酸锌（34.5%）均购于长沙兴嘉生物工程股份有限公司。

1.2 试验设计

1.2.1 试验一 选择420 只1 日龄肉仔鸡，设置7 个处理，分别为对照组（Ctrl）、无机锌（IZ30、IZ60、IZ90）组（30、60、90 mg/kg 硫酸锌）、有 机锌（OZ30、OZ60、OZ90）组（30、60、90 mg/kg 甘氨酸锌）。每个处理设置6 个重复，每个重复10 只鸡。试验日粮参考NRC（1994）肉仔鸡营养需要配制玉米- 豆粕型颗粒饲料，日粮组成与营养成分见表1。试验期42 d，网上平养，进行常规饲养管理。

1.2.2 试验二 选择336 只1 日龄肉仔鸡，设置7 个处理，分别为完全空白对照组（Ctrl）、生理盐水对照组（Ctrl-）、攻毒对照组（Ctrl+）、无机锌攻毒（IZ30+、IZ90+）组（30、90 mg/kg 硫酸锌）、有机锌攻毒（OZ30+、OZ90+）组（30、90 mg/kg 甘氨酸锌）。每个处理设置6 个重复，每个重复8 只鸡。攻毒组为LPS 攻毒。试验期42 d，网上平养，进行常规饲养管理。

1.3 样本采集与制备

1.3.1 试验一 于26 d 时，分别从每个重复中随机挑选1 只肉仔鸡，腿肌注射浓度为0.5%的牛血清蛋白（BSA）1 mL，并于注射后6、10、14 d 翅静脉采血，3 000 r/min 离心10 min 后分离血清冻存备用；于28 d 时，分别从每重复中随机挑选1 只肉仔鸡，静脉放血致死，立即剖开腹腔，迅速取胸腺、法氏囊、脾脏，称重；于39 d 时，分别从每个重复中随机挑选1 只肉仔鸡，翅静脉无菌采集EDTA 抗凝血。

1.3.2 试验二 于21 d 注射LPS 和生理盐水之前，称取笼重（空腹8 h）和余料重。于25 d 和42 d 时，称取笼重和余料重。于肉仔鸡25 d 和28 d 时，分别从每重复中随机挑选1 只肉仔鸡，静脉放血致死，立即剖开腹腔，迅速取胸腺、法氏囊、脾脏，称重；于肉仔鸡25 d时，分别从每重复中随机挑选1 只肉仔鸡，静脉放血致死，立即剖开腹腔，取脾脏和空肠样品放入液氮速冻后保存于-80℃。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 免疫器官指数 免疫器官指数=免疫器官重（g）/活体重（kg）

1.4.2 外周血淋巴细胞转化率 采用淋巴细胞体外培养和四甲基偶氮唑盐（MTT）检测外周血全血中T、B 淋巴细胞转化率，用伴刀豆球蛋白A（ConA）刺激T 淋巴细胞，用LPS 刺激B 淋巴细胞。

表1 基础日粮组成及营养成分

1.4.3 脾脏和空肠mRNA 相对表达量 实时荧光定量PCR测 定IL-1β、IL-8、TNF-α、NF-κB p65、TLR4 的mRNA相对表达量。总RNA 提取按照Invitrogen 公司提取步骤进行，随后用核酸蛋白测定仪ND-测定总RNA 的纯度和浓度。cDNA 合成采用反转录试剂盒（TaKaRa，大连）。采用 SYBR Green II 染料法进行实时荧光定量PCR，采用美国 ABI 7500 荧光定量PCR 仪进行测定，引物序列见表2。

1.5 统计分析 数据采用SPSS 19.0 One-Way ANOVA对7 个处理进行单因素方差分析，以P＜0.05 认为差异显著。差异显著则进行Duncan´s 多重比较。采用一般线性模型（GLM）对锌源和添加水平进行2×3 主效应分析，分别对硫酸锌组和甘氨酸锌组进行线性和二次曲线估计。

表2 Real time PCR 引物序列

2 结 果

2.1 锌源及锌水平对肉鸡免疫器官发育的影响 由表3可知，在试验一中，锌源和添加水平对免疫器官指数和肝脏指数无交互影响（P＞0.05）。但相对于对照组（Ctrl），各锌添加组可不同程度地提高肉鸡的胸腺指数，其中，IZ30 和OZ30 组的胸腺指数高于对照组（P＜0.05），且OZ30 组高于IZ30 组（P＜0.05）。

由表4 可知，在试验二中，最后一次LPS 刺激3 h后，与空白对照组（Ctrl）和生理盐水组（Ctrl-）相比，各攻毒组（Ctrl+、IZ30+、IZ90+、OZ30+、OZ90+）脾脏和肝脏指数显著升高（P＜0.05），添加锌并不能减轻LPS 刺激导致的脾脏指数和肝脏指数升高；法氏囊和胸腺指数无显著差异。最后一次LPS 刺激8 h 后，与空白对照组（Ctrl）相比，进行攻毒处理的锌添加组（IZ30+、IZ90+、OZ30+、OZ90+）脾脏指数显著升高，肝脏指数无显著变化；锌添加组（IZ30+、IZ90+、OZ30+、OZ90+）的法氏囊指数与攻毒对照组（Ctrl+）相比无显著差异，但不同锌添加水平对法氏囊指数有显著影响，0 mg/kg 锌添加组（Ctrl+）和30 mg/kg 锌添加组（IZ30+、OZ30+）的法氏囊指数高于90 mg/kg 锌添加组（IZ90+、OZ90+）（P＜0.05）；与空白对照组（Ctrl）相比，LPS 攻毒降低了胸腺指数（P＜0.05），日粮中添加锌可缓解LPS 刺激导致的胸腺指数下降，30 mg/kg甘氨酸锌的效果显著。

表3 28 d 免疫器官指数及肝脏指数（试验一） g/kg

2.2 锌源及锌水平对肉鸡外周血淋巴细胞转化率的影响由表5 可知，锌源、添加水平及二者的互作均可显著影响 39 d 外周血T 淋巴细胞转化率。相对硫酸锌，甘氨酸锌提高了39 d 外周血T 淋巴细胞转化率（P＜0.05），60 mg/kg 锌水平组（IZ60、OZ60）的转化率最高。锌源和添加水平对T 淋巴细胞转化率的互作效应显著，即随着锌添加水平的提高，且日粮中添加硫酸锌时，T 淋巴细胞转化率线性提高（P＜0.05），而当日粮中添加甘氨酸锌时，T 淋巴细胞转化率呈现二次提高（P＜0.05）。单因素方差分析结果显示，相比对照组，OZ30组、OZ60组、OZ90 组和IZ90 组的T 淋巴细胞转化率显著升高。锌源和添加水平的互作对外周血B 淋巴细胞转化率并无显著影响，但甘氨酸锌组的转化率高于硫酸锌组（P＜0.05）。

2.3 锌源及锌水平对肉鸡脾脏mRNA 相对表达量的影响 由表6 可知，最后一次LPS 刺激3 h 后，与Ctrl 组和Ctrl-组相比，攻毒组（Ctrl+、IZ30+、IZ90+、OZ30+、OZ90+）IL-1β、IL-8、TNF-α、TLR4 的基因表达显著升高。与Ctrl+组相比， IZ90+组和OZ30+组可提高IL-1β 的基因表达（P＜0.05）， IZ90+组可降低IL-8 和TLR4 的基因表达（P＜0.05）。由主效应分析可知，锌源、添加水平及二者的互作对IL-1β 的基因表达有显著影响，硫酸锌组IL-1β 的表达量高于甘氨酸锌组（P＜0.05），90 mg/kg 锌水平IL-1β 的表达量高于30 mg/kg锌水平及Ctrl+组（P＜0.05）。

表4 25 d LPS 攻毒3、8 h 后免疫器官指数（试验二） g/kg

表5 肉鸡外周血淋巴细胞转化率（试验一）

最后一次LPS 刺激8 h 后，相对Ctrl 组和Ctrl-组，攻毒组（Ctrl+、IZ30+、IZ90+、 OZ30+、OZ90+）IL-1β、IL-8 的基因表达上升（P＜0.05）。与Ctrl+组相比，各锌 添 加 组（IZ30+、IZ90+、OZ30+、OZ90+）IL-1β、TLR4 的基因表达下调（P＜0.05），IZ90+ 组、OZ30+组、OZ90+组可降低TNF-α 的基因表达（P＜0.05）。由主效应分析可知，添加水平及锌源和添加水平的互作对IL-1β、NF-κB p65 的基因表达有显著影响。甘氨酸锌组IL-8、TLR4 的基因表达均低于硫酸锌组（P＜0.05），硫酸锌组NF-κB p65 的基因表达低于甘氨酸锌组（P＜0.05）。随着锌添加水平的升高，IL-1β、TNF-α、TLR4 的基因表达降低（P＜0.05）。

2.4 锌源及锌水平对肉鸡空肠mRNA 相对表达量的影响由表7 可知，最后一次LPS 刺激3 h 后，LPS 刺激可上调空肠IL-1β、IL-8、TNF-α 基因表达（P＜0.05），上调NF-κB p65 基因表达（P＜0.05）。相比Ctrl+组，IZ90+ 组、OZ30+ 组、OZ90+ 组可提高IL-1β 基因表达（P＜0.05）。由主效应分析可知，锌源和添加水平对IL-1β 基因表达存在显著的交互作用，锌源和添加水平均显著影响IL-1β 的表达量，且甘氨酸锌组高于硫酸锌组（P＜0.05），随着锌添加水平的提高，IL-1β 的表达量随之提高（P＜0.05）。锌源和添加水平的互作可显著影响TNF-α 基因表达，表现为OZ30+组和IZ30+组无显著差异，而IZ90+组高于OZ90+组（P＜0.05）。

表6 LPS 最后一次注射3、8 h 后脾脏免疫相关基因的表达（试验二）

表7 LPS 最后一次注射3、8 h 后空肠免疫相关基因表达（试验二）

由表7 可见，在最后一次LPS 刺激8 h 后，LPS刺激可提高空肠IL-1β、IL-8、TLR4 基因表达（P＜0.05），而日粮中添加锌降低了上述3 个基因表达（P＜0.05）。其中，与Ctrl+组相比，各锌添加组（IZ30+、IZ90+、OZ30+、OZ90+）均可降低IL-1β 和IL-8 基因表达，IZ30+组、IZ90+组和OZ90+组可降低TLR4 基因表达（P＜0.05）。由主效应分析可知，锌源可影响IL-8、TLR4 基因表达，甘氨酸锌组的IL-8 表达量低于硫酸锌组（P＜0.05），但甘氨酸锌组TLR4 表达量高于硫酸锌组（P＜0.05）。随着锌添加水平的提高，IL-1β、IL-8、TLR4 的基因表达提高（P＜0.05）。

3 讨 论

3.1 锌对免疫器官发育的影响 免疫器官是淋巴细胞和其他免疫细胞发生、分化、成熟、定居、增殖以及产生免疫应答的场所，可分为中枢免疫器官和外周免疫器官。锌是直接参与免疫功能的重要生命相关元素，正常含量的锌有利于维持免疫器官的生长发育和保持正常的组织结构。锌缺乏则致使胸腺、脾脏、法氏囊等免疫器官生长发育不良，器官萎缩，重量减轻，而锌剂量过高可使免疫器官发生明显的病理变化。De Pasquale 等[1]和Pimental 等[8]均发现饲喂低锌日粮会引起肉仔鸡胸腺和法氏囊重量下降，与本研究结果一致。本研究还发现，日粮中添加中高剂量的锌可显著提高外周血T 淋巴细胞转化率，并缓解LPS 刺激8 h 后的胸腺指数下降，表明锌可提高机体的免疫机能。不管是在发育层面还是功能发挥层面，T 淋巴细胞对锌缺乏都尤为敏感。缺锌会导致胸腺萎缩及淋巴细胞减少症[9]。胸腺是T 细胞分化发育和成熟的部位，胸腺指数增加，表明T 淋巴细胞功能增强，细胞免疫功能得到强化。锌对胸腺的功能发挥也不可或缺，一种名为胸腺肽的胸腺激素依赖于锌。与T 淋巴细胞相比，B 淋巴细胞的发育和功能受锌变化的影响较小，但是锌缺乏仍然会导致B 细胞数量减少，影响未成熟及前成熟B 细胞的发育及抗体的产生[10]。

3.2 锌对炎性因子表达量的影响 LPS 又名内毒素，可引起免疫炎症反应，表现为大量细胞因子，尤其是炎性细胞因子的产生。细胞因子产生和炎症反应是有效免疫反应的重要过程。炎症反应过程中炎性细胞因子对代谢的调节作用而消耗养分和能量，降低畜禽的生产效率。长期低强度的炎症与很多疾病（如代谢病等）密切相关[11]。小鼠体内试验发现，锌缺乏会提高LPS 注射后的IL-6 和IL-1β 水平[12]。Perez 等[13]研究发现，肉鸡临界缺乏锌和锰会降低42 日龄IL-1β 和抗菌肽的基因表达，从而严重影响机体的抗炎能力。关于锌和锰在细胞信号转导上的作用也有报道，锌是将转录因子NF-κB结合到DNA 上的蛋白结构域的重要组分，添加适量锌可增强NF-κB 功能[14]。免疫反应不是将每一种细胞功能简单叠加聚合，而是在不同功能的可溶性介质的作用下，使不同种类的细胞完美合作。理想的免疫反应是针对不同的胞外或胞内病原体迅速且特异性地将其识别并清除[15]。本研究表明，LPS 刺激3 h 后，日粮中添加不同剂量的锌可显著地提高IL-1β 基因表达，增强短时间内炎症反应的强度，表明免疫机能增强。而在免疫后期炎症反应进入平稳阶段时，日粮中添加锌可通过抑制炎性细胞因子的表达减轻炎症对机体造成的损害，这与本试验中最后一次LPS 刺激8 h 后，各锌添加组脾脏IL-1β 和TLR4、空肠IL-1β 和IL-8 的基因表达相较攻毒对照组显著下调的结果相一致。

3.3 甘氨酸锌与硫酸锌 无机锌是微量元素添加剂的第一代产品，常用的添加形式为氧化锌和硫酸锌。无机锌的生物学利用效率很低，难以被机体吸收利用，而生产中为满足动物需要常常大剂量使用，长时间饲喂容易造成动物中毒和环境污染。氨基酸络合锌中因有配位键和离子键共存的独特结构，分子内电荷趋于中性，不易与其他物质结合或吸附，具有良好的化学稳定性；此外，氨基酸络合锌不仅是机体吸收金属离子的主要形式，又是动物体内合成蛋白质的中间物质，吸收速度快，可减少许多生化过程，节约体内能量消耗，具有较高的生物学利用效率。周锦兰等[16]研究表明，蛋氨酸能有效促进AA 肉鸡的生长发育，更有利于锌在动物体内的沉积；成廷水等[17]研究表明，饲粮中添加60 mg/kg 氨基酸锌可提高蛋鸡外周血淋巴细胞增殖转化率及BSA 抗体水平，使蛋鸡具有较强的抗病和抗应激能力，降低了疾病发生并提高了产蛋量及鸡蛋品质。本研究发现，与硫酸锌相比，日粮中添加同等剂量的甘氨酸锌可提高免疫器官指数，增强机体免疫机能，在炎症反应发生过程中可有效调节炎性因子的表达，降低炎症损伤。这可能与甘氨酸锌存在形式更为稳定、在机体内生物学利用效率更高有关。

4 结 论

日粮中添加30 mg/kg 甘氨酸锌和硫酸锌可显著提高肉仔鸡的胸腺指数，日粮中添加60 mg/kg 甘氨酸锌、90 mg/kg 硫酸锌和甘氨酸锌可显著提高T 淋巴细胞转化率。在免疫反应早期，日粮中添加锌可增强炎症反应强度；而在免疫反应后期，日粮中添加锌可通过抑制炎性细胞因子等的表达，缓解LPS 诱导的炎症反应，减轻慢性炎症反应损伤。甘氨酸锌比硫酸锌具有更强的调节功效。