对乙酰氨基酚对斑马鱼胚胎甲状腺激素相关基因表达的影响

康桂英，董 武，杨景峰，杨晓野

（1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特010018；2.内蒙古民族大学动物科学技术学院，内蒙古自治区毒物监控及毒理学重点实验室，内蒙古 通辽028000）

对 乙 酰 氨 基 酚（N-acetyl-p-aminophenol，APAP）是一种临床上广泛使用的解热镇痛药物，主要被用于感冒发热和缓解疼痛。来自美国的统计数据显示，APAP 成为急性肝功能衰竭的主要因素[1-2]，约50%的急性肝功能衰竭是由于超剂量使用APAP引起[3-4]。近些年，越来越多的流行病学研究表明，APAP 可能引起流产、早产、胎儿畸形和男性不育，并且影响神经发育，引起行为障碍[5-7]。研究发现，以上现象可能与APAP 破坏甲状腺激素的合成相关，被认为是一种新问题[8-10]。

体内甲状腺激素主要包含四碘甲状腺原氨酸（tetraiodothyronine，T4）和三碘甲状腺原氨酸（triiodothyronine，T3）。甲状腺激素的合成，先是碘化物在甲状腺过氧化物酶（thyroid peroxidase，TPO）的作用下被氧化成活性碘，活性碘与甲状腺球蛋白上的酪氨酸残基结合生成一碘酪氨酸和二碘酪氨酸。然后2个分子的二碘酪氨偶联生成T4；1个分子的一碘酪氨酸与1个分子的二碘酪氨发生偶联，形成T3，通常T4与T3之比为20∶1。T4通过二型脱碘酶（deiodinase type 2，DIO2）转换成具有极强生物活性的T3。T3在体内的含量及动态平衡对机体的生长、代谢具有非常重要的影响。而T3的转化灭活是由三型脱碘酶（deiodinase type 3，DIO3）来完成的，即转化成二碘甲状腺原氨酸（diiodothyronine，T2）作用失活而达到调节的目的[11-13]。T3 或T4 均有2 种存在形式，一种是与甲状腺结合球蛋白结合，称之为结合型；另一种呈游离状态，为游离型，这两者可以相互转化。T3进入细胞核后与甲状腺激素受体（thyroid hormone receptor，THR）结合而发生特定生理作用。斑马鱼有2种甲状腺激素受体亚型，一种是α 受体亚型（thyroid hormone receptor alpha，THRα），一种是β 受体亚型（thyroid hormone receptor beta，THRβ）。甲状腺素（thyroid hormone，TH）在有机体生长发育中起到其重要的调节作用，甲状腺素的不足将会造成胚胎发育迟缓，在人表现为呆小症。

酪氨酸和酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）与甲状腺素合成密切相关，同时也参与黑色素合成。TYR催化L-酪氨酸羟基化转变为3，4-二羟基苯丙氨酸（3，4-dihydroxyphenyl L-Alanine，DOPA）和多巴醌（dopaquinone，DQ），DQ 经过一系列转变后，形成黑色素[14]。1-苯基-2硫脲（1-phenyl 2-thiourea，PTU）是甲亢治疗药物，抑制甲状腺细胞内的过氧化酶系统，抑制甲状腺素的合成，在斑马鱼实验中也经常使用PTU 抑制黑色素而便于观察[15]。McMenamin 等[16]以斑马鱼为模型，探讨了斑马鱼甲状腺素对不同色素的发育以及调控起到非常关键的作用。斑马鱼作为疾病模型动物，具有对药物的敏感性、发育迅速、初期透明而容易观察和操作，繁育简单而费用低廉，特别是转基因斑马鱼的广泛应用为实验带来更多的便利，近年来使用斑马鱼进行药物的筛选以及毒性机制研究，有了长足的发展[17]。

本研究以斑马鱼为实验动物，以APAP 为受试药物，观察了斑马鱼眼部色素的变化情况，同时测定了总T3（total T3，TT3）或总T4（total T4，TT4）的含量，检测了TPO、Thrβ、Dio2、Dio3、Thrα和促甲状腺激素释放激素（thyrotropin-releasing hormone，Trh）等与甲状腺激素相关基因的表达情况，探讨APAP对斑马鱼甲状腺激素表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物、药物、试剂和主要仪器

实验所用斑马鱼为野生型AB 品系，由日本酪农学园大学赠送，在本实验室培育和繁殖。APAP（Sigma，美国），溶于0.1%二甲亚砜中备用。鱼类甲状腺素ELISA 检测试剂盒（上海信裕生物科技公司，中国）；反转录试剂盒（Promega，美国）；SYBR Green I PCR 反应混合液（大连，TaKaRa公司）；引物（上海生物工程有限公司合成），引物序列见表1。

Multiskan FC 型酶标仪（Thermo 公司，美国），5415R 型台式离心机（Eppendorf 公司，德国），DXM1200 数码照相机、E600 倒置显微镜及EclipseNet 图像分析软件（Nikon 公司，日本）。

1.2 动物分组和染毒

雌雄斑马鱼按1∶1 的比例放置在缸内，由隔板分开，次日清晨，取下隔板，待斑马鱼产卵后收集，将收集到的卵用斑马鱼培养液洗干净，在显微镜下挑选受精后4 h（four hours post fertilization，4 hpf）且发育一致的卵，移入6 孔板中，每孔10 枚。实验分4 组，分别为正常对照组、APAP 2，4 和8 mmol·L-1组，每个组设3 复孔，随后于光照培养箱中恒温28℃孵育，连续给药4 d，分别在24，48，72和96 hpf观察并记录分析。存活率（%）=胚胎存活数/胚胎总数×100%。孵化率（%）=已经孵化的胚胎数/胚胎总数×100%，心囊面积采用Image J软件测定，心囊面积（mm2）=各尾鱼的心囊面积之和/鱼尾数。

Tab.1 Primer sequences for RT-PCR

1.3 HE染色观察斑马鱼眼部视网膜色素沉积

APAP 2，4 和8 mmol·L-1对4 hpf 的斑马鱼胚胎进行染毒，同时设有正常对照组。在72 hpf，用4%的多聚甲醛进行固定，4℃过夜后，次日，用含有0.05%吐温-20 的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline with Tween-20，PBST）清洗2 次，每次60 min。再依次用20%、50%、70%、80%、90%和95%乙醇脱水，每次15 min，用100%乙醇清洗2次，每次15 min。再用二甲苯洗两次置换乙醇，每次10 min，然后将斑马鱼放入60℃的石蜡中，40 min后，倒出部分石蜡，再添入新的石蜡，60 min 后，将浸有斑马鱼的石蜡放置在常温，待石蜡凝固，用手术刀将蜡块修成菱形，固定在木块上。然后将木块固定在切片机上进行切片。切片的厚度为5 μm，切下的蜡片放入电热恒温水槽42℃展平，将载玻片45℃伸入水槽中，用铅笔拉动蜡片致载玻片上，将载玻片放置在平板凝胶真空干燥器上37℃干燥24 h 后，进行常规的HE 染色。HE 染色过程中，首先用二甲苯脱蜡两次，每次10 min，然后依次入100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇，80%乙醇和70%乙醇各2 min，蒸馏水5 min，苏木精2 min，蒸馏水3 min，1%盐酸乙醇21 s，蒸馏水30 s，0.5%氨水1 min，蒸馏水2 min，95%乙醇2 min，1.5%伊红溶液30 s，95%乙醇2 min，100%乙醇2次，每次2 min，树脂胶封片，显微镜下观察。

1.4 ELISA法检测TT3和TT4水平

对4 hpf 斑马鱼胚胎进行染毒7 d，收集正常对照组、APAP 2，4和8 mmol·L-1组幼鱼各50尾，每个组设3个重复。用去离子水清洗，弃清洗液，称重，按照每组鱼质量与PBS 体积比为1∶20，加入pH=7.2 PBS，0℃下进行匀浆，将匀浆液于10 000×g，4℃离心5 min，取上清液，用ELISA 试剂盒进行斑马鱼TT3和TT4的含量检测。

1.5 荧光定量PCR 检测甲状腺激素相关基因TPO，Trh，Dio2，Dio3，Thrα和Thrβ等的表达

给4 hpf 斑 马 鱼 胚 胎 暴 露APAP（2，4 和8 mmol·L-1），并设立正常对照组（每组10 尾，每个组设3 个复孔），暴露至72 hpf 时，各用去离子水清洗，弃去清洗液，加入100 μL焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）处理水。用匀浆器将斑马鱼充分打碎，加入900 μL Trizol，涡旋摇匀，加入200 μL氯仿，震荡15 s，混匀，10 000×g离心15 min后，吸取上层500 μL水相至无RNA酶的离心管中，之后加入500 μL 的异丙醇，摇匀后室温下静置5 min，10 000×g 离心15 min 后倒出上清液，在离心管中加入75%冰乙醇1 mL，涡旋，10 000×g 离心15 min 后用枪头吸出乙醇，再次加入1 mL 75%的冰乙醇清洗2 次，彻底将乙醇吸出后干燥10 min后加入30 μL DEPC 水，用基因测试仪测试所提取的RNA 浓度均＞240 mg·L-1，所有样品A260nm/A280nm≥1.9，A260nm/A230nm≥1.6。转录采用逆转录酶2 μL、5×buffer 4 μL、5 mmoL·L-1dNTP 4 μL、RNA酶 抑 制 剂1 μL、特 异 下 游 引 物1 μL 和 总RNA 500 μg，最后加无核酸酶水至20 μL；于37℃2 h，85℃5 min，然后4℃冷却5 min 后备用。SYBR Green I qRT-PCR 方法的建立：在20 μL 反应体系中，加入SYBR Green I PCR 反应混合液10 μL，每个基因（TPO，Trh，Dio2，Dio3，Thrα 和Thrβ）上下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL（1 ng），H2O 7 μL。反应40 个循环。内参基因为18 s，采用2-△△Ct法计算基因的相对表达。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 APAP对斑马鱼胚胎存活率和孵化率的影响

斑马鱼存活率结果（图1）显示，与正常对照组相比，在24～72 hpf，APAP 各组斑马鱼的存活率变化无统计学差异；在96 hpf，APAP 8 mmol·L-1组斑马鱼的存活率显著降低（P＜0.01）。

Fig.1 Effect of N-acetyl-p-aminophenol（APAP）on survival rate of zebrafish embryos. Zebrafish embryos were exposed to APAP 0（normal control），2，4 and 8 mmol·L-1 at 4 hours post fertilization（4 hpf）and observed at 24，48，72 and 96 hpf，respectively. 30 eggs per group.s，n=10. ＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

斑马鱼胚胎孵化率统计结果（图2）显示，与正常对照组相比，在72 和96 hpf 时，APAP 8 mmol·L-1组斑马鱼胚胎的孵化率显著下降（P＜0.01），其他组孵化率无统计学差异。

Fig.2 Effect of APAP on hatching rate in zebrafish embryos. See Fig.1 for zebrafish embryo treatment.s，n=10.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.2 APAP对斑马鱼胚胎心囊面积的影响

心囊面积结果（图3）显示，72 hpf时，与正常对照组相比，APAP 2，4 和8 mmol·L-1组的心囊面积分别增加了3.5，7.8和28.5倍（P＜0.01）。提示各浓度APAP都可引起不同程度心囊水肿。

Fig.3 Effect of APAP on pericardial area of zebrafish embryos at 72 hpf. See Fig.1 for zebrafish embryo treatmentn=10.＊＊P＜0.01，compared with normal control group. Arrows indicate pericardial edema.

2.3 APAP对斑马鱼视网膜黑色素的影响

斑马鱼视网膜黑色素沉积结果（图4）显示，72 hpf时，在正常对照组斑马鱼胚胎视网膜，黑色素在视网膜上均匀分布，色素沉着厚重。APAP 2 和4 mmol·L-1暴露组的黑色素在斑马鱼视网膜上分布不均，色素沉积降低；而8 mmol·L-1暴露组的黑色素分布尤为不均，色素沉积严重降低。提示各浓度APAP都可引起不同程度斑马鱼色素沉积降低。

2.4 APAP 对斑马鱼甲状腺激素含量的影响

斑马鱼甲状腺激素含量结果（图5）显示，从4 hpf给斑马鱼胚胎APAP 处理7 d，与正常对照组相比，APAP 8 mmol·L-1组斑马鱼组织匀浆TT3和TT4水平降低（P＜0.05，P＜0.01），APAP 2 和4 mmol·L-1组斑马鱼组织匀浆TT3 和TT4 水平与正常对照组无统计学差异。

Fig.4 Effect of APAP on pigmentation of retina of zebrafish eyes at 72 hpf（HE staining）. See Fig.1 for zebrafish embryo treatment.Arrows indicated pigment in eyes.

Fig.5 Effect of APAP on levels of total 3，3′，5-triiodothyronine（TT3）and total 3，5，3′，5′-tetraiodothyronine（TT4）in zebrafish embryos at 7 d. See Fig.1 for zebrafish embryo treatment. x±s，n=10. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.5 APAP 对斑马鱼甲状腺激素关联基因表达的影响

斑马鱼甲状腺激素关联基因表达结果（图6）显示，72 hpf时，与正常对照组相比，APAP 8 mmol·L-1组的TPO，Trh和Thrβ mRNA的相对表达量显著降低（P＜0.01），Dio2，Dio3 和Thrα mRNA 的相对表达量无显著变化。

Fig.6 Effect of APAP on mRNA expressions of TPO，Trh，Dio2，Dio3，Thrα and Thrβ in zebrafish embryos at 72 hpf. See Fig.1 for zebrafish embryo treatment.，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

3 讨论

本研究结果表明，APAP 给斑马鱼胚胎持续染毒，斑马鱼的形态发生心囊水肿变化，对斑马鱼的孵化率以及色素沉积有明显的抑制作用，引起孵化率降低、色素沉积降低以及死亡率的增加。与甲状腺激素密切关联的TPO，Thrβ和Trh基因表达也显著减低。

APAP对斑马鱼的孵化率有着明显的抑制作用，引起发育迟缓。在各个染毒组中，随着药物浓度的增高，斑马鱼的发育抑制越严重，在72 hpf，8 mmol·L-1组斑马鱼的孵化率只有对照组的58.75%。经过组织切片也确认视网膜黑色素的减低。通过荧光定量PCR 检测发现，APAP 有增高Dio2 基因表达，降低Dio3 基因表达的趋势，这有可能是体内T3 的不足所造成的反馈调节，以利于更多的T3的生成和存留。这反映了APAP对斑马鱼甲状腺素脱碘酶造成紊乱。

本研究中，与APAP 2 mmol·L-1组相比，4 mmol·L-1组Trh 基因表达有增高的趋势，这可能与其标准差较大有关，但无显著统计学意义，不影响整体结果分析以及结论。与正常对照组相比较，APAP 2 和4 mmol·L-1组Thrβ 基因的表达没有浓度依存的降低，而8 mmol·L-1组Thrβ基因的表达显著降低，这可能是由APAP低浓度代偿引起。有关机制还有待进一步研究。

APAP 能够通过胎盘屏障，对胎儿造成一定的影响，尤其是器官发育造成终生影响。APAP 主要用于解热去痛，其原理是通过抑制环氧合酶1 和环氧合酶2，从而抑制前列腺素而发挥作用[18-19]，但对色素沉着的干扰的机理还不明了[20]。本研究不但发现色素的减低，还引起孵化率的显著降低。斑马鱼体内甲状腺素含量测定发现，APAP 造成TT3 和TT4 的显著降低，推断APAP 造成的毒性症候群与甲状腺激素紊乱相关联。TPO 是甲状腺激素合成的重要酶类，TPO 直接决定T4 和T3 的合成，而T3是斑马鱼胚胎变态发育中重要的激素，TPO基因表达的降低，势必减少相关酶类的分泌而造成T4 和T3量的减少。T3量的减少将会引起斑马鱼胚胎发育障碍[17，21]，本研究结果提预示TPO基因表达量的降低致使T3 水平的降低，进而引起孵化率的降低。Trh 是垂体前叶的促甲状腺激素释放激素，主要刺激促甲状腺激素的分泌，进而促进T4 和T3 的分泌。本研究发现，APAP 降低了Trh 基因的表达。Thrβ是T3的受体，Thrβ表达量的减低致使T3的结合受限，而不能发挥甲状腺激素的机能，最终造成色素降低，孵化率低下以及形态学变化。这也与我们之前的研究相符，Thrβ表达量的降低可能引起斑马鱼胚胎色素的降低和发育障碍。

本研究结果显示，APAP 可降低TPO，Trh 和Thrβ基因的表达，这可能与T3的含量变化有关，推测APAP 影响甲状腺激素相关基因的表达，进而影响生长发育。