银杏内酯通过抗炎和抗氧化保护缺血再灌注导致的大鼠心肌损伤

刘永强，刘 辉，韩培立，周朝元，崔勤涛

（新乡医学院第一附属医院1.心外科，2.心内科 河南新乡453100）

心肌缺血再灌注（myocardial ischaemia-reperfusion，MI/R）损伤是冠心病患者手术治疗后的严重并发症之一，可引起心肌细胞大量死亡、心肌组织炎性浸润及氧化应激等病理现象，严重影响手术对冠心病的治疗效果。而作为威胁人类生命的一大常见病，每年全球约有70万人死于冠心病，近年来，我国冠心病发病率逐年递增，且患者逐渐低龄化[1-2]。手术再灌注是应对冠心病心肌缺血的主要治疗方法，因此，减轻术后MI/R 损伤对改善冠心病患者治疗有重大意义。研究表明，MI/R损伤中的炎症反应及氧化应激可导致心肌组织损伤严重，缓解炎症反应及氧化应激可减轻心脏手术引起的MI/R损伤[3]。而银杏内酯（bilobalide，BB）具有显著的抗炎及抗氧化作用。研究发现，BB 可显著抑制缺氧引起的脂肪细胞炎症反应及过氧化氢诱导的黑色素细胞氧化应激，降低胃溃疡及脑I/R 损伤组织中炎症因子的表达，减少肥胖患者脂肪组织中氧自由基的产生[4]。有研究发现，BB 有抑制MI/R 大鼠心肌细胞凋亡的作用[5]，但BB 对MI/R 损伤氧化应激和炎症反应等影响及作用机制仍不明确，本研究对BB 在MI/R 损伤中的影响及作用机制进行深入探索，为提高冠心病治疗效果提供新的选择。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

BB 购自美国Sigma 公司；伊文思蓝购自北京鼎国生物技术公司；肌酸激酶MB型同工酶（creatine kinase MB isoenzyme，CK-MB）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）检测试剂盒购自美国Cayman公司；HE染色试剂盒、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒和DAB 显色液购自上海碧云天生物公司；兔抗大鼠白细胞介素6（interleukin- 6，IL-6）、Ki67、Bcl-2、Bax、NF-κB P65、NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκBα）和IκBα激酶（IκBα kinase，IKK）多克隆抗体（一抗）购自美国Santa Cruz 公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗购自武汉三鹰公司；兔抗大鼠活化的胱天蛋白酶3、NF-E2相关因子2（nuclear transcription factor EF-E2-related factor 2，Nrf2）、血红素氧合酶（heme oxygenase 1，HO-1）和NAD（P）H醌脱氢酶1〔NAD（P）H quinone dehydrogenase 1，NQO1〕多克隆抗体（一抗）购自美国Abcam 公司；磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、IL-1β、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-10 ELISA试剂盒购自美国Invitrogen公司。

1.2 大鼠、Ml/R模型制备和分组

30只雄性SD大鼠，6～8周龄，体质量180～220 g，合格证号SCXK（京2012-0001），实验动物许可证SYXK（豫）2018-0005，随机分为5组，每组6只。大鼠ip给予戊巴比妥钠麻醉后，气管连接呼吸机。术前消毒后开纵切口于第三四肋骨间，暴露心脏。正常组大鼠只分离不结扎。结扎大鼠左冠状动脉前降支，当心肌颜色由红转白且心电图ST段持续弓背升高时开始记时，持续30 min后，解除结扎进行再灌注。以心肌由白转红且ST段下降为再灌注成功的标准。术后缝合切口。造模成功后1 d，BB与1%羟基纤维素钠混合后，按照分组分别ig给予等量生理盐水和BB 2，4和8 mg·kg-1，每日1次，连续4周。4周后检测各组大鼠心率（heart rate，HR）。处死大鼠后，收集外周血，分离心脏组织，并将组织进行石蜡包埋，用于后续检测。

1.3 心肌梗死面积检测

取1.2 分组大鼠，结扎大鼠冠状动脉时注射伊文蓝于左心室中，对未心梗死部位进行染色，用于切片观察。切片于1% TTC 溶液中37℃染色15 min。切片蓝染区为正常心肌组织，未着色区为缺血梗死心肌组织，苍白区为坏死心肌组织。通过Image-Pro Plus 6.0 测量切片中组织总面积及梗死区面积。心肌梗死面积百分比（%）=梗死区面积/组织总面积×100%。

1.4 试剂盒检测血清CK-MB和LDH的浓度

取各组大鼠血液，室温下静置30 min后，2500×g离心10 min取上清。按试剂盒说明书进行实验，用比色法进行测定，得到各组CK-MB及LDH浓度。

1.5 HE染色观察心肌组织病理变化

将石蜡切片脱蜡后，放入苏木精染色液中，洗涤后伊红复染，脱水，封片。其中紫蓝色为细胞核，红色为细胞质及细胞外基质。

1.6 TUNEL检测心肌细胞凋亡

石蜡切片脱蜡、修复后，利用内源性过氧化物酶封闭液作用5 min。洗涤后滴加TUNEL检测液，于37℃避光孵育1 h。洗涤后再滴加DAB显色液进行显色，苏木精复染。其中棕色为凋亡细胞，蓝色为正常细胞。细胞凋亡率（%）=凋亡细胞数目/总细胞数目×100%。

1.7 ELlSA 检测心肌组织中SOD，GSH-Px活性和MDA含量及血清中lL-1β，TNF-α和lL-10浓度

将1.2 各组心肌组织研磨成匀浆，用于检测SOD，GSH-Px活性和MDA含量。从各组外周血中分离出血清，用于检测IL-1β，TNF-α 和IL-10 浓度。实验步骤按Invitrogen试剂盒说明书进行实验。避光显色后，通过酶标仪检测各组样品吸光度值，按说明书公式计算其浓度。

1.8 免疫组化检测心肌组织Ki67和lL-6的表达

石蜡切片脱蜡、修复后，滴加一抗稀释液（1∶1000），4℃孵育过夜。洗涤后滴加对应二抗（1∶2000），室温静置45 min，37℃孵育50 min。洗涤后滴加链酶蛋白亲和素，37℃作用50 min。洗涤后滴加DAB显色液避光显色，苏木精复染。棕色为抗原蛋白阳性细胞，蓝色为正常细胞。用阳性细胞率表示Ki67和IL-6的表达。

1.9 Western印迹检测心肌组织Bax、Bcl-2、活化的胱天蛋白酶3、Nrf2、HO-1、NQO-1、p-lKK、p-lκBα和NF-κB P65蛋白表达水平

RIPA 裂解组织，提取1.2 各组心肌，BCA 试剂盒定量蛋白，调平各组蛋白浓度。取各组蛋白30 mg，10% SDS-PAGE 将蛋白分离，半干转膜法将蛋白转移至PVDF 膜上。脱脂奶粉室温封闭2.5 h，一抗（1∶1000）4℃过夜，二抗（1∶2000）37℃1 h，最后曝光显色，以GAPDH 为内参。用目标蛋白与内参蛋白积分吸光度值的比值表示蛋白的相对表达水平。

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 BB对Ml/R 大鼠心肌梗死面积百分比、心率及血清中CK-MB和LDH 浓度的影响

表1和表2结果显示，与正常对照组相比，MI/R模型组心肌梗死面积百分比显著升高，大鼠HR 显著下降，血清中CK-MB 及LDH 浓度显著升高（P＜0.01）；与MI/R 模型组比较，MI/R 模型+BB 2，4 和8 mg·kg-1组心肌梗死面积百分比显著降低（P＜0.05，P＜0.01），HR 显著升高（P＜0.05，P＜0.01），血清中CK-MB 及LDH 浓度显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。BB可显著减轻MI/R造成的心肌梗死损伤。

Tab.1 Effect of bilobalide（BB）on myocardial infarction area and heart rate（HR）of myocardial ischemia reperfusion（Ml/R）model rats

2.2 BB对Ml/R 大鼠心肌形态的影响

正常对照组大鼠心肌组织中，心肌纤维完整，排列整齐，无纤维断裂及炎性细胞浸润。MI/R模型组心肌组织中红细胞明显增多，心肌纤维结构杂乱，出现心肌纤维断裂及炎性浸润现象。与MI/R模型组比较，MI/R 模型+BB 2 mg·kg-1组中红细胞及炎症细胞发生明显减少；MI/R 模型+BB 4 mg·kg-1组中心肌纤维排列较为规则，纤维断裂明显减少；MI/R模型+BB 8 mg·kg-1组中心肌组织损伤得到显著缓解，纤维排列规则，炎症细胞浸润明显减少。表明BB可显著缓解MI/R造成的心肌组织损伤（图1）。

Tab.2 Effect of BB on serum content of creatine kinase MB isoenzyme（CK-MB）and lactate dehydrogenase（LDH）of Ml/R model rats

Fig.1 Effect of BB on myocardial morphology in Ml/R model rats（HE staining）. See Tab.1 for the rat treatment.Arrows show the fibers were well arranged and inflammatory cell infiltration was markedly reduced.

2.3 BB对Ml/R 大鼠心肌细胞凋亡的影响

与正常对照组比较，MI/R模型组大鼠心肌细胞凋亡明显增多，凋亡细胞百分比显著上升（P＜0.01，图2）。与MI/R 模型组比较，MI/R 模型+BB 2，4 和8 mg·kg-1组中凋亡细胞明显减少，凋亡细胞百分比显著下降（P＜0.05，P＜0.01）。表明BB 可显著降低MI/R引起的心肌细胞凋亡。

Fig.2 Effect of BB on apoptosis of myocardiocytes of Ml/R model rats（TUNEL staining）. See Tab.1 for the rat treatment. Arrows show the apoptotic cells. ±s，n=6. ＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with MI/R model group.

2.4 BB 对Ml/R 大鼠心肌组织中SOD，GSH-Px 活性和MDA浓度的影响

与正常对照组比较，MI/R模型组大鼠心肌组织中SOD 及GSH-Px 活性显著降低（P＜0.01），MDA浓度显著升高（P＜0.01）。与MI/R模型组比较，MI/R模型+BB 2，4和8 mg·kg-1组中SOD及GSH-Px活性显著升高（P＜0.05，P＜0.01），MDA浓度显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。表明BB可显著减弱MI/R造成的自由基氧化损伤（表3）。

2.5 BB 对Ml/R 大鼠血清lL-1β，TNF-α 和lL-10 水平的影响

与正常对照组比较，MI/R模型组大鼠外周血中IL-1β，TNF-α 和IL-10 水平显著升高（P＜0.01）。与MI/R模型组比较，MI/R模型+BB 2，4和8 mg·kg-1组中IL-1β 和TNF-α 浓度显著降低（P＜0.05，P＜0.01），IL-10 浓度显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。表明BB可显著改善MI/R导致的炎症反应（表4）。

Tab.3 Effect of BB on activities of superoxide dismutase（SOD），glutathione peroxidase（GSH-Px）and malondialdehyde（MDA）in myocardial tissue of Ml/R model rats

See Tab.1 for the rat treatment. s，n=6. ＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with MI/R model group.

Tab.4 Effect of BB on serum interleukin-1β（lL-1β），tumor necrosis factor-α（TNF-α）and lL-10 of Ml/R model rats

2.6 BB 对Ml/R 大鼠心肌组织Ki67 和lL-6 表达水平的影响

与正常对照组比较，MI/R模型组大鼠心肌组织中Ki67和IL-6表达显著增多，Ki67和IL-6阳性细胞百分比显著上升（P＜0.01，图3）。与MI/R模型组比较，MI/R 模型+BB 2，4 和8 mg·kg-1组中Ki67 表达显著增多，Ki67阳性细胞百分比显著上升（P＜0.05，P＜0.01），而IL-6表达显著减少，IL-6阳性细胞百分比显著降低（P＜0.05，P＜0.01，图3）。

2.7 BB 对Ml/R 大鼠心肌组织Bcl-2、Bax 和活化的胱天蛋白酶3表达水平的影响

Fig.3 Effect of BB on expression levels of Ki67（A1，A2）and lL-6（B1，B2）in myocardial tissue in Ml/R model rats detected by immunohistochemistry. See Tab.1 for the rat treatment. Arrows show the positive cells. A2 and B2 was the semi-quantitative result of A1 and B1，respectively.±s，n=6. ＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01 compared with MI/R model group.

与正常对照组比较，MI/R模型组大鼠心肌组织中Bcl-2的表达显著减少，Bax和活化的胱天蛋白3的表达显著增多（P＜0.01，图4）。与MI/R模型组比较，MI/R模型+BB 2，4和8 mg·kg-1组中Bcl-2的表达显著增多，Bax 和活化的胱天蛋白酶3 的表达显著减少（P＜0.05，P＜0.01，图4）。表明MI/R 可显著促进心肌组织细胞凋亡，BB 可显著抑制MI/R 引起的细胞凋亡。

2.8 BB 对Ml/R 大鼠心肌组织中Nrf2，HO-1 和NQO1蛋白表达的影响

与正常对照组比较，MI/R模型组大鼠心肌组织中Nrf2，HO-1 和NQO1 的表达显著降低（P＜0.01，图5）。与MI/R 模型组比较，MI/R 模型+BB 2，4 和8 mg·kg-1组中Nrf2，HO-1 和NQO1 的表达显著增加（P＜0.05，P＜0.01，图6）。实验结果表明，MI/R可激活Nrf2 信号通路，BB 可通过促进Nrf2，HO-1 和NQO1表达提高心肌组织对氧化应激的抵抗能力。

2.9 BB Ml/R 对大鼠心肌组织中p-lKK，p-lκBα 和NF-κB P65蛋白表达的影响

与正常对照组比较，MI/R模型组大鼠心肌组织中p-IKK、p-IκBα 和NF-κB P65 表达显著升高（P＜0.01，图6）。与MI/R 模型组比较，MI/R 模型+BB 2 mg·kg-1组中p-IKK 及NF-κB P65 表达显著降低（P＜0.05，图6），p-IκBα 表达无显著差异；BB 4 和8 mg·kg-1组中p-IKK、p-IκBα和NF-κB P65表达显著均显著降低（P＜0.01，图6）。实验结果表明，MI/R可激活心肌组织中的NF-κB 信号通路，BB 可显著抑制MI/R对NF-κB信号通路的激活作用。

Fig.4 Effect of BB on expressions of Bcl-2，Bax and cleaved-caspase 3 in myocardial tissue of Ml/R model rats detected by Western blotting. See Tab.1 for the rat treatment. B was the semi-quantitative result of A. x±s，n=6. ＊＊P＜0.01 compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with MI/R model group.

Fig.5 Effect of BB on expressions of nuclear factor erythroid 2-related factor 2（Nrf2），heme oxygenasae 1（HO-1）and NAD（P）H：quinone oxidoreductase（NQO1）in rat myocardial tissue of Ml/R model rats detected by Western blotting. See Tab.1 for the rat treatment. B was the semi-quantitative result of A.s，n=6. ＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with MI/R model group.

Fig.6 Effect of BB on expressions of phosphorylated inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase（p-lKK），phosphorylated inhibitor of NF-κB kinase α（p-lκBα）and NF-κB P65 in myocardial tissue of Ml/R model rat detected by Western blotting. See Tab.1 for the rat treatment. B was the semi-quantitative result of A.±s，n=6. ＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with MI/R model group.

3 讨论

本研究结果显示，BB 可减小MI/R 模型大鼠心肌梗死面积百分比，降低大鼠外周血中CK-MB 和LDH浓度，提高大鼠心率，减轻心肌组织损伤程度。且随着用药浓度由2 mg·kg-1递增至8 mg·kg-1，BB对MI/R 大鼠的保护作用愈显著。心肌组织损伤程度降低、心肌梗死面积减小表示MI/R病情得到显著改善。前人研究显示，BB 可降低局灶性脑缺血模型的脑梗死面积，减轻脑组织损伤[7]。另外有研究显示，BB 可降低一氧化氮诱导的大鼠肾上腺髓质PC12 细胞中LDH 的含量[8]。当细胞受到损伤，通透性升高时，LDH被由胞质释放到细胞外。CK-MB和LDH 是检测人类心脏疾病的经典生物标志物，CK-MB 和LDH 在血液中的浓度越高，表明心肌细胞损伤越严重。

本研究结果显示，BB 可升高MI/R 模型大鼠心肌组织中的Ki67 阳性细胞百分比和Bcl-2 表达，降低凋亡细胞百分比及Bax和活化的胱天蛋白酶3表达，随BB用药浓度的升高，其产生的抗凋亡促存活作用愈显著。Bcl-2 与Bax 的比值作为检测细胞凋亡的常用指标，Bcl-2/Bax 比值增加从侧面体现BB抑制心肌细胞凋亡。在MI/R中，心肌细胞凋亡水平显著升高，导致收缩细胞丧失及心肌细胞代偿性肥大，从而进一步促使MI/R 病情恶化。因此，有效抑制心肌细胞凋亡和增加细胞存活可阻止MI/R 的发展。前人研究显示，BB 可抑制某些细胞凋亡的发生，如在帕金森病，BB可抑制α-合成核蛋白聚集体诱导的神经元细胞凋亡[9]；在中毒性肝损伤中，BB可阻碍马缨丹烯诱导豚鼠肝细胞凋亡的发生[10]。

本研究结果显示，BB 可降低MI/R 模型大鼠外周血中的IL-1β和TNF-α浓度及心肌组织中的IL-6阳性细胞百分比，升高外周血中IL-10的浓度，且随BB 用药浓度的升高，其产生的抗炎作用越明显。研究显示，BB 能显著降低乙醇诱导的胃溃疡模型大鼠胃组织中IL-6，IL-1β及TNF-α的水平[5]。IL-6，IL-1β 和TNF-α 等促炎症因子，能促进心肌组织炎性浸润，刺激其他炎症因子的表达，加剧心肌炎症的反应[11]。IL-10 是一种抗炎症因子，能抑制心肌组织炎症反应的过度发生[12]。

本研究结果显示，BB 可抑制MI/R 模型大鼠心肌组织中p-IKK，p-IκBα和NF-κB P65的表达，且随BB 用药剂量增加，其对NF-κB 活化的抑制作用越明显。据报道，BB 可显著抑制脂肪细胞、胃黏膜细胞、神经元细胞和巨噬细胞中NF-κB的激活[13]。而在MI/R中，NF-κB被高度激活并显著促进炎症反应的发生，抑制NF-κB激活可显著减轻心肌组织中的炎症反应[14]。

本研究结果显示，BB 可使MI/R 模型大鼠心肌组织中SOD 和GSH-Px 活性升高，而MDA 浓度显著降低。前人研究显示，银杏叶中提取的类黄酮成分可通过清除氧自由基缓解MI/R 造成的组织损伤[16]。SOD 及GSH-Px 是清除氧自由基的主要酶类，可保护机体细胞膜结构完整，MDA是氧自由基与细胞膜脂质的氧化产物，其浓度越高表示组织氧化损伤越严重，可作为评估氧化应激水平的指标[17]。

本研究发现，BB 可显著提高MI/R 模型大鼠心肌组织中Nrf2，HO-1 和NQO1 的表达。有研究显示，在神经元细胞中，BB可通过激活细胞Nrf2/HO-1信号通路预防氧化应激对神经元的损伤[18]。Nrf2/HO-1 信号通路是经典的抗氧化通路之一，过度激活Nrf2/HO-1 信号通路可显著减轻MI/R 造成的组织损伤[19]。HO-1 及NQO1 是重要的抗氧化蛋白，当机体发生氧化应激时，Nrf2蛋白被激活并进入细胞核，作为受Nrf2调控的靶蛋白，HO-1及NQO1在Nrf2入核后大量产生，并通过自身的抗氧化作用对组织器官进行保护[20]。

综上所述，BB 可显著减轻MI/R 引起的心肌组织损伤，降低MI/R模型大鼠心肌组织中的细胞凋亡水平，抑制心肌组织炎症反应和氧化应激反应，其作用机制可能与抑制NF-κB的活性，诱导Nrf2信号通路激活相关。