湖南省部分规模猪场保育仔猪细菌感染调查及药敏检测分析
2019-08-12张古月余俊达卿任科李润成
龙 剑，张古月，余俊达，卿任科，李润成
（湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128）
随着养猪业规模化、集约化的不断发展，以及养猪生产中免疫抑制性因素增加，猪的细菌性疾病日益严重，大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）、猪链球菌（Streptococcus suis,SS）、副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）、巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）等已经成为影响规模猪场生猪生长的主要细菌病原，严重威胁着猪场的健康生产和经济效益[1]。2013—2017年，华中农业大学动物疾病诊断中心对9 961个猪场的47 175份样本进行细菌分离，检测数据发现细菌性感染以 E.coli、SS、HPS、Pm 为主，其中HPS与SS成为我国养猪业的主要致病菌[2]。而保育仔猪由于自身免疫力低下，更容易受到细菌性病原的感染，因此，科学预防和控制保育仔猪的细菌性疫病，成为了促进养猪业发展的一个重要课题。
为调查湖南省规模猪场保育仔猪细菌感染及药物敏感情况，文章对2018年湖南怀化、郴州、常德等地10个规模猪场，80头病、死保育仔猪的425份病料进行细菌分离、PCR鉴定及药敏试验，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 样品来源
2018年，从湖南怀化、郴州、常德等地10家规模猪场，采集80头临床表现关节肿胀、呼吸困难、体温升高、食欲不振、精神抑郁，神经症状等病、死保育仔猪样本，每头包括肺、脾、肾、淋巴结、关节液等。
1.2 培养基
TSB、LB、BHI培养基均购于Oxoid公司；巧克力营养琼脂平板购于贝瑞特公司；鲜血营养琼脂平板购于江门公司。
1.3 主要试剂
小牛血清购买于益康生物公司；革兰氏染色试剂及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）购买于北京索莱宝科技有限公司；即用型PCR试剂盒3.0（MIX）及DNA提取试剂盒购买于北京天恩泽生物技术有限公司；DL 2 000 DNA Marker购于康为世纪公司；药敏纸片购买于杭州微生物公司。
1.4 引物合成
E.coli、SS、HPS、Pm 鉴定引物参照文献[3-6]的方法由擎科生物技术有限公司合成。各引物信息见表1。
表1 各细菌鉴定引物信息
1.5 细菌分离及鉴定
1.5.1 细菌分离与镜检 无菌取病变组织或关节液划线接种于巧克力培养基，37℃温箱培养36 h，根据平板上细菌生长情况及菌落形态，从形态相同、数量上具有优势的菌落群中，挑取单菌落分离纯化、涂片镜检。然后，根据疑似菌种，选择特定类型的液体培养基37℃、180 r/min摇床中培养12 h增菌培养。
1.5.2 细菌鉴定 按照试剂盒操作说明提取DNA做为模板，并按照疑似菌种情况，选择PCR引物进行PCR鉴定。PCR反应体系均为20 μL，包含10μL mix，7 μL 蒸馏水，引物 2 μL，DNA 模板 1 μL。
PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，参照表1退火温度退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环，最后72℃再次延伸7 min。PCR结束后，取5 μL于1.0%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
1.6 药敏试验
使用K-B法对分离菌株进行药敏试验，将培养好的各优势菌株用无菌生理盐水稀释至0.5麦氏单位浓度，吸取100 μL稀释菌液用涂布器均匀涂于巧克力平板上，待平板上菌液干燥后将药敏试纸轻轻贴在巧克力琼脂上，于37℃温箱培养12～36 h（根据细菌种类确定具体培养时间）后记录抑菌环的直径并根据其结果判断分离菌株对不同药物的敏感程度。
2 结果
2.1 细菌分离与镜检
通过细菌生长形态和革兰氏染色初步鉴定，主要优势菌株代表性革兰氏染色镜检结果见图1—图4。
图1 疑似大肠杆菌
图2 疑似猪链球菌
图3 疑似副猪嗜血杆菌
图4 疑似猪巴氏杆菌
2.2 PCR鉴定
将不同优势菌株根据镜检疑似情况，选用相应鉴定引物进行PCR鉴定。代表性鉴定结果见图5—图8。可见不同引物均有扩增出特异性的条带（E.coli特异性条带为264 bp、SS为657 bp、HPS为821 bp、Pm 为 460 bp）。
图5 E.coli样品PCR产物电泳
图6 SS样品PCR产物电泳
图7 HPS样品PCR产物电泳
图8 Pm样品PCR产物电泳
2.3 细菌分离统计
检测到 E.coli、SS、HPS、Pm 的阳性头数分别为42头、39头、24头、12头，分别占比 52.5%（42/80）、48.8%（39/80）、30.0%（24/80）、15.0%（12/80），其中 2种及2种以上细菌混合感染39头，占48.8%（39/80），具体分离情况见表2。
表2 湖南10个规模猪场采集样本数及细菌感染情况
2.4 药敏试验结果
对分离到的 E.coli（7株）、SS（10株）、HPS（7株）、Pm（5株）进行药敏试验，结果见表3。细菌对大部分常见抗生素都有一定的耐药性，其中SS、HPS、Pm对阿莫西林、恩诺沙星、多西环素、头孢曲松和氟苯尼考较为敏感，对链霉素、林可霉素耐药严重；而E.coli表现出很强的耐药性，仅对恩诺沙星、头孢曲松、大观霉素、庆大霉素较为敏感，部分分离株对常用药物均耐药。
表3 分离菌对12种常见抗生素的敏感性比例 %
3 讨论
调查结果表明，湖南规模猪场保育仔猪细菌感染以 E.coli、SS、HPS、Pm 为主，其中链球菌在 10 个猪场均分离为阳性，猪场阳性率最高，其次为大肠杆菌、然后依次为副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌。分离菌中多数SS、HPS、Pm对阿莫西林、恩诺沙星、头孢曲松、多西环素、氟苯尼考较为敏感，但20%的SS、Pm对氟苯尼考已形成耐药，10%SS对阿莫西林、恩诺沙星以及14.3%的HPS对恩诺沙星产生耐药。E.coli作为常见的耐药菌之一，对大部分药物耐受甚至部分菌株对常用药物均已形成耐药，这与何启盖调查研究相符[2]。同时，有部分样品未分离到任何细菌，但不说明没有细菌感染，这与病料样品的保存与病、死前是否大量使用抗生素等因素有关。
正常情况下，大部分细菌对动物机体无害，属条件性致病菌。梁媛对2008—2010年广西65家规模猪场引起呼吸道细菌性疾病调查结果表明，单纯细菌感染不易引发猪只呼吸道疾病，常与猪繁殖与呼吸综合征或猪圆环病毒2型等免疫抑制性疾病混合感染[7]，降低了猪只的免疫应答能力，当天气变化、饲养管理不当、生猪流动等外界不良因素影响时，条件性致病菌在体内大量繁殖，从而引起感染导致死亡率升高。从本文的调查情况来看，2种以上细菌混合感染的生猪占48.8%，同类型的菌株药敏特性存在差异，如果把各种细菌耐药谱均考虑在内，很可能无药可用，且病毒感染情况，因未进行检测，尚不清楚。可见，保育猪疾病的防控比较复杂，在进行疾病诊断时建议选择发病早、中、晚期的小猪进行实验室检测分析，查清原发、继发病原以及继发病原继发的先后顺序。以便为保育猪的预防、治疗以及科学用药提供有用的参考依据。
