南极磷虾脂类成分的抗炎活性研究
2019-08-12田晓清常俊男李月月陆亚男樊成奇
田晓清 ,常俊男 ,2,李月月 ,2,陆亚男 ,樊成奇
(1.中国水产科学研究院东海水产研究所,水产品质量安全与加工实验室,上海 200090;2.上海海洋大学食品学院,上海 201306)
南极磷虾Euphausea superba脂类营养成分含量丰富,其脂肪酸中二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)相对含量高于15%,总磷脂含量达到油脂提取物的30%以上,南极磷虾中还含有总虾青素高于3 mg·100-1·g-1[1-3]。目前,南极磷虾油(krill oil)是相关产品中营养功效和附加值都很高的产品,挪威的Aker Biomarine公司开发成功的磷虾油SKO(superbaTMkrill oil)已畅销欧美市场,商业利润极大。
南极磷虾油除了具有改善大脑健康、提高免疫、抗肿瘤等许多医疗保健功能外[4],还具有一定抗炎功效[5],但功效成分类型和作用靶点未见文献报道。本研究以粗磷虾油为原料,根据脂肪酸和磷脂理化性质差异,精制获得不同部位,并利用体外模型进行了抗炎活性筛选。
1 实验部分
1.1 仪器与材料
1.1.1 仪器
不锈钢豆浆机(DJ12B-DSG1型),广东美的精品电器制造有限公司;旋转蒸发仪(RE-3000),上海亚荣生化仪器厂;低温冷冻离心机 (TS-211C);高效液相色谱仪:Agilent 1260 HPLC,VWD可变波长检测器,OpenLab CDS 色谱工作站;Shimadazu,LC-20AT pump,SIL-20A auto sampler,SPD-M20A PDA;高速逆流色谱(TBE-300C),上海同田生物技术股份有限公司。
1.1.2 实验材料
生物材料:冰冻南极磷虾(方砖:80 cm×40 cm×10 cm)来自2014年冬季南极磷虾探补渔船,-78℃冰冻保存,使用前1周转移至-18℃冷冻保存备用。
试剂:预制GF254 TLC硅胶板(青岛海洋化学公司);液相用乙腈和甲醇(色谱级,Tedia,USA);其余溶剂、试剂均为分析纯(上海国药集团)。
1.2 方法
1.2.1 提取
根据文献[3]报道,在室温条件下,分别取3批次冰冻磷虾,每批次1 200 g,采用固液比1:2.5、提取时间5 min、混合溶剂EA/BuOH比例为1:1的条件提取。真空浓缩干燥后,分别获得磷虾粗油48.8 g、53.2 g、49.0 g,提取率分别为4.07%、4.43%、4.08%。
1.2.2 分离和酯化
3份磷虾粗油首先分别经10倍体积(v·m-1)的无水乙醇沉淀除去固体杂质,再分别用10倍体积(v·m-1)的丙酮在4℃沉淀过夜,离心分离得到浅黄色膏状物磷虾极性脂和深红色透明磷虾油。其中,分别获得3份极性脂11.1 g、12.9 g、13.3 g,产率分别为22.8%、24.2%、27.2%;所得磷虾极性脂利用HPLC(Agilent 1260)外标法,以卵磷脂、磷脂酰乙醇胺为对照品,在206 nm测定了极性脂中磷脂总含量。获得的深红色透明磷虾油分别为38.7 g、40.3 g、35.7 g,产率分别为77.2%、75.8%、72.8%,脂肪酸成分未作分析。
称取40 g磷虾油,利用乙醇钠/乙醇回流4 h进行乙酯化,用0.5 M的稀盐酸中和,蒸出乙醇后用正己烷萃取、回收油相浓缩得粗轻油乙酯;进一步利用高速逆流色谱分离提纯,单次进样量800 mg,收集得到EPA+DHA乙酯含量较高的磷虾轻油乙酯混合物,重复多次进样,合并收集的洗脱液,真空浓缩干燥后到磷虾轻油乙酯11.3 g。并利用HPLC(Shimadazu 20AT)在215 nm归一化法分析了磷虾轻油乙酯纯化产物中EPA+DHA乙酯含量。
1.2.3 抗炎活性测试
在抑制LPS诱导的巨噬细胞NO生成实验中,通过Griess反应测定小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的NO生成。实验分为空白、对照组、LPS诱导模型组、受试化合物组(实验组)。RAW264.7细胞以5.0×105·mL-1密度接种于96孔板中,于温度37℃,5%CO2的条件下,使用DMEM培养液培养24 h。空白对照组细胞不做处理;LPS模型组细胞加入500 ng·mL-1LPS刺激24 h。各给药组分别给以受试物预孵30 min,然后加入500 ng·mL-1LPS刺激24 h。取50 μL细胞上清液,依次加入等体积Griess试剂A、Griess试剂B,轻轻振荡数次,待各孔反应液完全混匀后,于540 nm波长检测各孔OD值,根据公式计算NO抑制率。
采用ELISA方法检测磷虾极性脂、轻油、轻油乙酯对LPS诱导的巨噬细胞RAW 264.7中IL-8和IL-6细胞因子表达水平的影响。实验设置空白对照组、模型组、给药组,RAW 264.7巨噬细胞以5.0×105·mL-1密度接种于96孔板中,每孔100 μL培养基,培养24 h。空白对照组细胞不做处理,模型组加LPS 500 ng·mL-1刺激24 h,分别加入相应浓度受试物预孵30 min后,加入LPS 500 ng·mL-1刺激 24 h。IL-8,IL-6蛋白表达标准曲线按照如下步骤制作:
①加入标准品稀释液到冻干标准品IL-8或IL-6中,待彻底溶解后,静置15 min混匀(浓度为2 000 pg·mL-1)。标曲使用以下浓度:1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0 pg·mL-1。
②除空白孔外,分别将不同浓度标准品(100 μL/孔)加入反应孔,用封板胶纸封住反应孔,37℃温箱孵育90 min,用洗涤液洗板4次。
③每孔加入生物素化抗体工作液100 μL,用封板胶纸封住反应孔,37℃孵箱孵育60 min,洗板4次。
④每孔加入酶结合物工作液100 μL,用封板胶纸封住反应孔,37℃孵箱孵育30 min,洗板4次。
⑤每孔加入显色剂 100 μL·孔-1,避光反应 10~20 min。
⑥每孔加入终止液100 μL·孔-1,混匀后即刻测量450 nm处吸光度OD值。
⑦标准品的OD值减去空白孔的OD值,以标准品浓度作横坐标,OD值作纵坐标,绘制标准曲线。
收集各个受试样品组的细胞培养液上清,取100 μL加入反应孔中,设2个复孔,余下步骤同上,根据标准曲线,计算每组IL-8,IL-6蛋白的表达情况。
2 结果与讨论
2.1 南极磷虾脂质不同组分的制备
根据文献分别提取3批次冰冻磷虾,获得磷虾粗油提取率达到4.07%、4.43%、4.08%,稍低于文献[3]报道,除所用南极磷虾原料不同外,提示应随着原料用量增加,适当延长剪切提取的循环时间。
利用低温沉淀法进行了磷虾粗油的分离,得到浅黄色膏状物磷虾极性脂和深红色透明磷虾轻油。其中,极性脂产率分别为22.8%、24.2%、27.2%,以磷脂为主,利用HPLC外标法测得极性脂中磷脂总含量分别为53.5%、66.0%、75.4%,平均含量65.0%(标准曲线如图1,样品图谱如图2);磷虾轻油产率分别为77.2%、75.8%、72.8%,未能检测到卵磷脂、磷脂酰乙醇胺等磷脂成分。结果表明磷虾粗油中,脂肪酸成分存在形式以甘油酯为主,磷脂占比较小,通过溶剂低温沉淀,能较好地分离这两类成分。
磷虾轻油经乙醇钠/乙醇回流乙酯化反应,萃取得粗轻油乙酯;进一步反复利用高速逆流色谱分离提纯,得到EPA+DHA乙酯含量较高的磷虾轻油乙酯混合物,总产率28.25%。利用HPLC在215 nm归一化法分析得到纯化后磷虾轻油乙酯产物中EPA+DHA乙酯含量为61.5%,另含十六碳烯酸、油酸乙酯分别为3.7%、5.4%(HPLC图如图3)。
图1 卵磷脂标准曲线图Fig.1 Standard curve of the phosphatidylcholine
图2 南极磷虾油中测得卵磷脂样品图Fig.2 Liquid chromatogram of phosphatidylcholine in the Antarctic krill
图3 样品中EPA+DHA的HPLC图谱Fig.3 Liquid chromatogram of EPA+DHA in the Antarctic krill
2.2 南极磷虾脂质不同组分的抗炎活性
在抑制LPS诱导的巨噬细胞NO生成实验中,磷虾极性脂、轻油、轻油乙酯在NO产生抑制模型中IC50分别为146.1、129.9和52.9 μg·mL-1,且都呈剂量相关性,其中轻油乙酯活性相对较好(图1a)。
图4 磷虾极性脂、磷虾油和轻油乙酯的体外抗炎活性结果Fig.4 Anti-Inflammatory Activity of polar lipid,oil and Ethyl ester fraction of light oil from Antarctic krill
采用ELISA方法检测磷虾极性脂、轻油、轻油乙酯对LPS诱导的巨噬细胞RAW 264.7中IL-8和IL-6细胞因子表达水平的影响。结果显示:IL-8细胞因子含量测试中磷虾轻油活性优于其它2个组分 (图4b),IL-6细胞因子含量测试中则是轻油乙酯活性最佳(图4c),且都呈剂量相关性。
活性筛选结果表明:南极磷虾油抗炎功效的主要活性成分为多不饱和脂肪酸如EPA、DHA等,脂肪酸甘油酯混合物也显示一定的抗炎活性,而磷虾磷脂类成分活性相对较弱。
关于南极磷虾油改善心脑血管、提高免疫、抗肿瘤等的研究比较多[4],抗炎活性的研究较少,主要都聚焦于总磷虾油的体内、体外抗炎活性[6]。本研究对磷虾油制备得到的不同类型的成分进行了活性跟踪,发现最强抗炎活性成分。活性筛选结果表明:南极磷虾油抗炎功效的主要活性成分为多不饱和脂肪酸如EPA、DHA等,脂肪酸甘油酯混合物也显示一定的抗炎活性,而磷虾磷脂类成分活性相对较弱。
3 我国南极磷虾油产品开发应用前景
南极磷虾虾油中含有丰富的EPA、DHA和磷脂、虾青素等营养物质,尤其适用于心脑血管疾病的预防和治疗,因此磷虾油产品附加值高,市场预期好。如果能进一步精制开发细分产品,有望丰富产品类型,综合提升产品附加值,适应不同的症状,满足不同的消费需求。
本研究利用磷虾油尝试制备了1种抗炎有效部位小试产品磷虾轻油乙酯,通过定量分析明确其中EPA+DHA乙酯含量,为61.5%,另含十六碳烯酸、油酸乙酯分别为3.7%、5.4%;体外抗炎活性结果显示磷虾轻油乙酯具有较强活性,且呈剂量相关,其抗炎作用主要表现为抑制炎症因子NO、IL-6。磷虾极性脂虽然磷脂平均含量达到65.0%,但抗炎活性微弱。
在开发南极磷虾虾油衍生产品过程中,已经有较多相关专利[7-9],必须考虑各类有效成分的理化特性,尽量针对性地利用低温、真空等加工过程,在产品形式、制备工艺、制剂上大胆创新,才能最终开发出拥有自主知识产权、品质优良的磷虾油终端产品。本研究首次尝试在南极磷虾油精制过程中使用了高速逆流色谱技术[10-11]分离超低极性的油脂类化合物,较之于反相HPLC等固相色谱技术,载样量提升较大,样品回收率高,分离效果也达到了预期目的。
致谢:感谢中山大学药学院尹胜教授团队进行磷虾极性脂、磷虾油和轻油乙酯抗炎活性评价,感谢上海同田生物技术股份有限公司指导EPA+DHA乙酯的纯化试验。