血清miR-145、miR-29联合miR-217检测在膀胱癌的表达差异及价值分析

邱厚兵，王春燕，彭 胡，杨清明

（泸州市中医医院检验科，四川 泸州646000）

膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位［1］。2012年中国恶性肿瘤发病和死亡分析显示膀胱癌的发病率约为6.61／10万，列恶性肿瘤发病率的第9位［2］。膀胱癌的发病率随年龄增长而不断增加，高发年龄50～70岁［2］。目前膀胱癌的诊断主要依据膀胱镜，但该操作为有创性检查，给病人造成较大的痛苦，不宜在人群中普及；此外，患者多因无痛性肉眼血尿这一症状就诊时被发现，严重影响患者预后。故而，寻找有效、可靠的生物学标志物无疑可为膀胱癌的治疗赢得时间，对提高患者生存率，改善其生存质量具有重要意义。微小RNA（microRNA，miR）是一类长度约为22核苷酸的非编码RNA，其与肿瘤的发生、发展及转移密切相关［3-4］。近年来研究发现多种miR在膀胱癌患者体内存在异常表达，且与癌细胞增殖、侵袭与转移等密切相关［5-6］。本研究通过比较分析膀胱癌、膀胱炎患者及健康对照血清miR-145、miR-29联合miR-217水平差异，分析三者与膀胱癌临床病理特征之间的关系及对膀胱癌的鉴别诊断价值。

材料和方法

1 研究对象的纳入

本研究经医院伦理委员会批准。选取2016年2月至2018年5月在我院经穿刺或术中病理切片确诊的膀胱癌患者80例，其中Ⅰ～Ⅱ期患者51例，Ⅲ～Ⅳ期患者29例；发生淋巴结转移26例，未发生淋巴结转移54例。膀胱癌的诊断及临床分期依据美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）2016年第2版指南［7］。同期收取80例膀胱炎患者和80例我院健康体检者。膀胱炎的诊断依据《尿路感染诊断与治疗中国专家共识（2015版）》［8］。纳入标准：①意识清楚，能正常进行沟通；②自愿参与本研究并签署知情同意书；③未经手术及放化疗治疗。排除标准：①既往有其他肿瘤疾病史者；②排除有癫痫史或精神病患者；③患者或患者家属不愿意参与者。

2 基本资料采集与血清miR-145、miR-29、miR-217检测

由专业研究人员记录所有研究对象年龄、性别、体质指数（body mass index，BMI）、吸烟史、饮酒史等基本信息。三组间在年龄、性别、BMI、吸烟史及饮酒史的差异均无统计学意义（P＞0.05），表明三组间具有可比性，见表1。

使用促凝采血管收集经禁食10 h以上膀胱癌和膀胱炎患者接受治疗前和健康对照者入院体检时的外周静脉血5mL。收集的标本在1 h内于4℃条件下以3500g离心力（离心半径为10cm）离心10min，收集上层血清。

血清RNA的提取：按照血清RNA提取试剂盒说明书步骤进行总血清RNA提取。取上述提取的RNA，使用去除基因组反转录试剂盒反转录为cDNA，进行实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，RT-PCR）检测。RT-PCR按照SYBR GREEN说明书进行，反应体系为：Mix 10μL，上下游引物各0.8μL，cDNA 2μL，DEPC水6.4μL。循环条件：95℃变性5min；95℃30s，63℃30s，72℃30s，40个循环。应用PrimerPremier5.0进行PCR引物设计，引物合成由北京赛百盛基因技术有限公司提供，序列如下：miR-145上游引物：5’-AGTGTGTCATTCCC AGT-3’，下游引物：5’-TGGAACCAGCTGCATT-3’；miR-29上游引物：5’-TACAACCCACTACCTG-3’，下游引物：5’-TGGAATGCAGGCTGCT-3’；miR-217上游引物：5’-CGAACGACCGAAG-3’，下游引物：5’-GCCAAGTTAGATAAGC-3’；内参基因U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。采用2-ΔCt法计算miR的相对表达量，△Ct值＝样本Ct值-U6 Ct值。血清miR-145、miR-29、miR-217和U6基因熔解曲线峰型单一，说明引物没有形成引物二聚体，见图1。

表1 三组间临床资料比较

图1 miR-145、miR-29、miR-217和U6基因熔解曲线峰型

3 统计学处理

应用SPSS 19.0软件进行分析。正态分布数据资料采用均值±标准差（）表示，两组间和多组间比较分别采用t检验和方差分析。率的比较采用卡方检验。相关性分析采用Spearman检验。受试者工作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC）分析计算血清miR-145、miR-29、miR-217水平判别膀胱癌的曲线下面积（area under ROC curve，AUC）。将本研究人群分为膀胱癌与非膀胱癌（膀胱炎组及健康组）两组，自变量为年龄、性别、吸烟、饮酒、BMI、miR-145、miR-29和miR-217水平等因素，因变量为是否发生膀胱癌，采用二元Logistic回归，应用Wald向前法分析并计算miR-145、miR-29和miR-217水平预测膀胱癌发病风险的比值比（odds ratio，OR）。本实验的检验水准为 α＝0.05，P小于0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

1 三组间血清miR-145、miR-29和miR-217水平比较

膀胱癌患者血清miR-145、miR-29和miR-217表达水平（检测结果经负对数转换后呈正态分布）显著低于膀胱炎患者和健康对照者（P＜0.05），而膀胱炎患者和健康对照者间血清miR-145、miR-29和miR-217水平差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 三组间血清miR-145、miR-29和miR-217水平比较

2 血清miR-145、miR-29和miR-217与膀胱癌临床特征的关系

如表3所示，血清miR-145、miR-29和miR-217表达水平与膀胱癌患者年龄、性别、吸烟史、饮酒史和BMI等因素均无明显关系（P＞0.05），而与膀胱癌淋巴结转移（miR-145：r＝-0.514，P＝0.006；miR-29：r＝-0.465，P＝0.020；miR-217：r＝-0.487，P＝0.023）及TNM分级（miR-145：r＝-0.501，P＝0.016；miR-29：r＝-0.449，P＝0.003；miR-217：r＝-0.509，P＝0.007）呈线性关联。

表3 血清miR-145、miR-29和miR-217与膀胱癌临床特征的关系

3 血清miR-145、miR-29和miR-217对膀胱癌的鉴别价值

ROC曲线分析显示，血清miR-145、miR-29和miR-217在区分膀胱癌与膀胱炎患者和健康对照的AUC分别为0.825（95%CI：0.732～0.918，P＜0.001）、0.889（95%CI：0.764～0.947，P＜0.001）和0.752（95%CI：0.658～0.826，P＜0.001）；对应的灵敏度／特 异 性 分 别 为：81.3%／82.9%、82.7%／89.7%和77.2%／83.3%；诊断界值分别为12.4（-log）、34.2（-log）和24.6（-log），见图2A。联合血清miR-145、miR-29和miR-217在区分膀胱癌与膀胱炎患者和健康对照的AUC为0.937（95%CI：0.894～0.977，P＜0.001），灵敏度91.7%，特异性84.7%，见图2B。

图2 血清miR-145、miR-29和miR-217对膀胱癌鉴别价值

4 血清miR-145、miR-29和miR-217水平对膀胱癌的风险评估

将本研究人群分为膀胱癌与非膀胱癌（膀胱炎组及健康组）两组，自变量为年龄、性别、吸烟、饮酒、BMI、miR-145、miR-29和miR-217水平等因素，因变量为是否发生膀胱癌。二元Logistic回归分析结果，见表4。单因素分析显示，血清低miR-145、低miR-29和低miR-217是膀胱癌的危险因素；多因素分析显示，在校正了年龄、性别、吸烟、饮酒、BMI后，血清低miR-145、低miR-29和低miR-217是膀胱癌的独立危险因素。

表4 血清miR-145、miR-29和miR-217水平对膀胱癌的风险评估

讨 论

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。生物标志物是血液、尿液或者组织中能检测疾病状态的分子指标，可用于疾病的检测［9-10］。理想的生物标志物应具有较高的灵敏度和特异性，且在非肿瘤患者体液中其水平不会增高。

miR是近年生物标志物领域的研究热点，其作为基因调控因子能在转录后水平抑制靶基因的表达或蛋白质翻译，已被证实在多种肿瘤中存在异常表达。miR-145、miR-29和miR-217是近年研究发现的可能在膀胱癌发展中起重要作用的三个抑癌基因。MINAMI等［11］观察到上调miR-145后可显著下调下游促癌靶基因Krüppel样因子4的表达，进而降低膀胱癌T24细胞系的增殖与迁移能力，并促进癌细胞凋亡。EKMAN等［12］运用基因芯片对兔子膀胱癌模型筛查发现，与健康兔子相比，膀胱癌模型兔子组织中miR-29表达显著降低。而HUANG等［13］发现环状RNA hsa_circ_0000144可抑制miR-217表达，进而通过抑制miR-217下游抑癌基因RUNX2促进膀胱癌的发生发展。虽然关于miR-145、miR-29和miR-217在膀胱癌相关细胞学和动物模型等机制研究已有报道，但关于三者在膀胱癌患者中的表达差异及临床价值分析仍未见报道。

本研究我们通过临床样本血清中的检测发现，膀胱癌患者血清miR-145、miR-29和miR-217水平显著低于膀胱炎患者和健康对照，miR-145、miR-29和miR-217三者对膀胱癌发生发展有抑制作用，而其在膀胱癌患者血清中表达水平的降低也与前期多个机制研究结果相互呼应，进一步证实三者是膀胱癌重要的抑癌基因［11-13］。进一步分析发现，低miR-145、低miR-29和低miR-217水平与膀胱癌患者发生淋巴结转移和TNM分级相关，且发生淋巴结转移和处于Ⅲ～Ⅳ期患者的血清miR-145、miR-29和miR-217水平降低最显著，前期多个学者在细胞学和动物体内研究均发现miR-145、miR-29和miR-217可通过靶向干预多个下游通路分子如Krüppel样因子4、RUNX2等参与抑制膀胱癌的侵袭与转移，减缓癌症进展，这也解释了患者血清中miR-145、miR-29和miR-217水平在淋巴结转移及Ⅲ～Ⅳ期时显著低于未发生淋巴结转移和Ⅰ～Ⅱ患者［11，13］，表明血清低miR-145、低miR-29和低miR-217与膀胱癌的发生发展关系密切，且三者水平对患者疾病进展具有一定的预警价值。ROC曲线分析显示，血清miR-145、miR-29和miR-217在区分膀胱癌与膀胱炎患者和健康对照的灵敏度／特异性分别为81.3%／82.9%、82.7%／89.7%和77.2%／83.3%；而联合三者后在区分膀胱癌与膀胱炎患者和健康对照的灵敏度显著提高，达到91.7%，提示联合血清miR-145、miR-29和miR-217具有较高的诊断价值。进一步二元Logistic回归分析显示，在校正了年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒后，血清低miR-145、低miR-29和低miR-217是膀胱癌的独立危险因素。证实了血清miR-145、miR-29和miR-217水平差异可作为膀胱癌的诊断指标。然而，本研究仍有如下不足值得注意：①由于纳入的人群均来自我院，上述三项miR指标在我国其他地区膀胱癌患者中是否仍存在表达差异有待进一步多中心的队列研究来验证；②本研究纳入80例膀胱癌患者，对于本次研究结果的解读仍需慎重，需要今后更大样本量的研究来证实。

综上，通过本次实验我们发现血清miR-145、miR-29和miR-217的表达差异在膀胱癌中的诊断价值以及在评估膀胱癌患者发生肿瘤远处转移中均具有重要的临床意义，有望为膀胱癌患者的诊疗及预后改善提供新的途径与思路。