血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α联合检测对早期肝硬化的预后评估价值

胡晓蕾，邹 仪

（成都市西区医院消化内科，四川 成都610000）

肝硬化是临床常见的慢性进行性肝病，由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害，主要为肝炎性肝硬化、酒精性肝硬化以及目前已少见的血吸虫性肝硬化［1］。由于我国是乙肝大国，病毒性肝炎性肝硬化在临床上最为常见［2］。晚期肝硬化可导致一系列致命的并发症，如上消化道大出血、肝性脑病、肝癌等［3］。寻找可靠的生物学指标对肝硬化患者的病情进行检测，可有效预防致命性并发症的发生，对肝硬化患者预后的提高具有重要意义。前期研究发现，血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α在消化道肿瘤及肝硬化患者中存在异常表达［3-6］，我们推测三者对肝硬化患者的预后评估具有潜在价值。在本研究中，我们比较了血清高lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α水平组与对应的低水平组的患者的生存率及病情程度，旨在探究联合血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α三项指标对肝硬化的预后评估价值，以期为肝硬化患者的病情监测提供新思路。

材料和方法

1 研究对象

收集2010年1月至2013年1月在我院确诊的早期肝硬化患者共330例，年龄36～60岁，平均年龄48.1±12.4岁。研究对象的纳入标准如下：①经病理学确诊为肝硬化；②Child分级均为A级；③均为首次确诊为肝硬化，入院前未经过其他治疗。所有研究对象均排除：呼吸系统疾病、恶性肿瘤、心绞痛、心肌梗死等心血管疾病与自身免疫性疾病。Child分级标准参照1972年Pugh修改后的分级标准［7］。由研究人员对研究对象的基本临床信息如性别、年龄、吸烟史、饮酒史、体质指数（body mass index，BMI）等进行采集。所有纳入对象均签署知情同意书，本研究开展经本院伦理委员会批准。

2 血清学指标的检测

患者入院次日清晨，由专业医护人员使用含促凝剂采血管采集空腹外周血10mL。血液标本在1 h内于4℃条件下以12000g离心力离心15min，收集上层血清进行lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α与肝纤维化指标III型前胶原（procollagenⅢ，PCIII）、IV型胶原（collegen type IV，IV-C）、层粘连蛋白（laminin，LN）、透明质酸酶（hyaluronidase，HA）等的检测。lncRNA MT1JP的检测方法为实时荧光定量PCR，检测仪器为Bio-Rad PCR仪V115883，检测试剂由康维世纪公司提供。实时荧光定量PCR按照SYBR GREEN说明书进行，反应体系为：Mix 10μL，上下游引物各0.8μL，cDNA 2μL，DEPC水6.4μL。荧光定量PCR循环条件：95°C变性5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，45个循环，每组设置3个复孔。使用的引物序列为：lncRNA MT1JP上游引物：5’-AGTGT GTCATAGAGCTTCCTGTTTCATCTCCCAGT-3’下 游引物：5’-TGGAACCAGGCCCCAGGGAATCTTTCAGC TGCATT-3’；GAPDH上游引物：5’-GGGAGCCAAAA GGGTCAT-3’，下游引物：5’-GAGTCCTTCCACGATA CCAA-3’；采用2-ΔΔCt法计算lncRNA MT1JP的相对表达量，△Ct值＝目的基因Ct值-GAPDH Ct值。CEA的检测方法为化学发光法，检测仪器为Architect i2000全自动化学发光免疫分析仪，检测试剂为专用配套试剂（美国雅培公司）。TNF-α的检测采用双抗体夹心酶联免疫吸附法，检测仪器为SpectraMax iD5多功能酶标仪（深圳迈瑞公司），试剂盒购自美国ADL公司。肝纤维化指标的检测均采用罗氏C501全自动生化仪，试剂为罗氏原装试剂。操作过程均严格按照试剂盒说明书进行。以上所有检测项目质控及标本检测均严格参考仪器及试剂说明书，由本科室专业人员严格把控。

3 随访

依据患者纳入本研究的时间，依次对其进行五年随访，统计随访期间的死亡人数及对应的死亡时间。随访结束后，由专业医护人员对存活患者进行Child分级，并抽取外周静脉血进行肝纤维化指标的检测。检测过程同上。

4 统计学处理

本研究应用SPSS 19.0软件进行统计学分析。正态分布数据采用均值±标准差（）表示，两组间比较采用两独立样本t检验。率的比较采用卡方检验。采用Kaplan-Meier法进行生存曲线分析，应用对数秩检验（log-rank test）计算生存曲线间的统计学差异。应用受试者工作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC）分析计算三项指标联合检测对肝硬化患者五年内存活与否的判别能力，计算曲线下面积（area under the cure，AUC）、灵敏度与特异性。本次实验的检验水准为α＝0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 患者的血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α水平与基本临床资料

患者的血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α水平符合正态分布，三项指标的均值分别为12.77±0.20（-log），8.12±2.08 pg／mL，690.42±93.75μg／L，中位数分别为12.53（-log），8.88pg／mL，693.17μg／L。依据血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α水平对患者进行分组，各组患者的基本临床资料见表1。如表所示，患者的年龄、性别、BMI、PCIII、IV-C、LN、HA等基本资料的差异无统计学意义（P＞0.05），可比性良好。

表1 患者的基本临床资料

2 生存分析

经过五年随访，共有34例患者死亡，0例患者失访。采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验进行生存曲线分析，见图1。相比高lncRNA MT1JP组，低lncRNA MT1JP组患者的生存时间显著缩短（χ2＝10.593，P＝0.001，图1-A）；相比低CEA组，高CEA组患者的生存时间显著缩短（χ2＝4.792，P＝0.029，图1-B）；相比低TNF-α组，高TNF-α组患者的生存时间显著缩短（χ2＝13.113，P＜0.001，图1-C）。

图1 血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α水平与早期肝硬化患者的生存分析

3 存活患者的肝纤维化指标水平与Child分级

随访结束后，296例存活患者的肝纤维化指标水平与Child分级见表2。如表所示，相比于高lncRNA MT1JP、低CEA、低TNF-α水平组，低lncRNA MT1JP、高CEA、高TNF-α水平组患者的PCIII、IV-C、LN、HA水平均显著升高，Child分级中C级患者所占比例显著增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表2 存活患者的肝纤维化指标水平与Child分级

4 血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α对肝硬化患者是否生存五年的鉴别诊断

将330例患者分为两组：五年内存活组与五年内死亡组。如图2所示，血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α在鉴别肝硬化患者是否生存五年的AUC分别为：0.897（95%CI：0.770～0.960，P＜0.001）、0.813（95%CI：0.712～0.921，P＜0.001）和0.648（95%CI：0.570～0.757，P＝0.002）；在各指标约登指数为最大值时对应的灵敏度及特异性分别为：83.9%／79.6%、76.3%／82.6%和69.1%／58.7%，见图2-A；联合血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α三项指标在鉴别肝硬化患者是否生存五年的AUC为0.937（95%CI：0.842～0.981，P＜0.001），灵敏度为81.7%，特异性为91.8%，见图2-B。

图2 血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α对肝硬化患者是否生存五年的鉴别诊断

讨 论

我国是乙肝大国，而肝硬化则是慢性乙肝的主要并发症之一［8］。早期肝硬化持续发展可导致消化道大出血、肝性脑病、肝癌等并发症，严重威胁患者生命［9］。寻找可靠的指标对早期肝硬化患者的病情进行监测，可为肝硬化的临床干预提供依据，对其并发症的预防具有重要意义。

lncRNA MT1JP是一种新发现的lncRNA，可通过调节靶基因转录后的水平参与肿瘤的生物学功能，目前已在胃癌、结肠癌等消化道肿瘤中检测到lncRNA MT1JP低表达，并起着抑癌基因的作用［10］。LIU等［10］应用基因芯片技术对包括肝癌、肺癌、胃癌及结肠癌等76对癌及癌旁消化道肿瘤患者组织中检测lncRNA MT1JP水平，发现与癌旁组织相比，癌组织中lncRNA MT1JP水平显著降低。进一步的机制研究，他们还发现抑癌基因p53是lncRNA MT1JP的靶基因，当lncRNA MT1JP下调时，人正常肝细胞L02和肝癌细胞HepG2中p53蛋白水平下降，进而加速细胞恶化和肿瘤形成。肝硬化的重要并发症即是癌变，而早前的研究也指出，p53参与肝硬化的进程。KOUTB等［11］发现，与对照者相比丙型肝炎性肝硬化患者血浆p53基因显著下调。综合上述研究可以推测，lncRNA MT1JP通过正向调控p53，参与肝硬化的发生发展。在本次研究中，我们发现血清低lncRNA MT1JP水平肝硬化患者的生存率显著降低，而PCIII、IV-C、LN、HA等肝纤维化程度指标的水平及Child分级中C级患者比例均显著升高，该结论与我们的假设相一致，表明血清高lncRNA MT1JP水平是肝硬化的一种保护因素。CEA是一种广谱的肿瘤标志物，在消化道肿瘤患者中的表达水平增高［12］。近年来的研究发现，CEA在肝硬化患者体内亦存在异常表达。例如，戚玉海等［13］检测了38例慢性乙型肝炎与57例肝硬化患者的血清CEA水平，发现CEA在肝硬化失代偿期时明显升高，对判断肝硬化病情有一定参考意义。在本次研究中，我们发现，相比于低水平组，血清高CEA水平组的肝硬化患者的五年生存率降低，这些研究结果提示，CEA除可用作肿瘤标志物外，还具有用于肝硬化病情监测的潜能。TNF-α是由激活的巨噬细胞产生的能杀死肿瘤细胞的一种活性物质［14］。研究发现，TNF-α对肝硬化的临床转归有一定参考价值。刘德福等［15］对120例肝硬化患者的腹水TNF-α水平进行检测发现，乙肝肝硬化患者首次腹水中TNF-α水平增高是提示患者预后不良的重要因素，具有重要的临床预测价值。这一结论在国外研究中也被证实［16］。NAGAI等［16］指出，血清TNF-α水平可用于评估肝硬化患者接受索拉非尼治疗的疗效评估，且当索拉非尼用量在400 mg／d时患者血清TNF-α下降最为显著，治疗效果也最明显。在本次研究中，我们发现，血清高TNF-α水平组的肝硬化患者的五年生存率降低，而PCIII、IV-C、LN、HA等肝纤维化程度指标的水平及Child分级中C级患者比例均显著升高，该研究结果与前期国内外研究相呼应，表明高TNF-α是肝硬化患者不良预后的因素之一。

此外，血清高lncRNA MT1JP与低CEA、低TNF-α水平组肝硬化患者的肝纤维化指标PCIII、IVC、LN、HA在五年内的变化不大，而低lncRNA MT1JP与高CEA、高TNF-α水平组肝硬化患者的肝纤维化指标则显著增高，且Child分级中C级患者所占比例亦显著升高，这些结果提示，lncRNA MT1JP可延缓肝纤维化进程，而CEA与TNF-α则可加速肝纤维化化进程，三者有望成为肝纤维化的治疗靶标。

综上所述，本研究探究了血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α三项指标对早期肝硬化的预后评估价值，有望为肝硬化的临床诊疗提供新思路。