亚临界流体萃取沉香挥发油工艺的优化及精制精油测定

沈汝青, 朱 力, 冯志豪, 朱宝璋, 谭 亮, 丁 恺, 陆 麒, 丁志刚,丁 俊

(1.海南香岛休闲农业科技发展有限公司,海南 海口570208；2.广州市浩立生物科技有限公司,广东广州510220；3.中国科学院西北高原生物研究所,青海省青藏高原特色生物资源研究重点实验室,青海 西宁810001；4.青海省草原总站草原保护科,青海 西宁810000)

沉香为瑞香科植物沉香Aquilaria agallocha(Lour.)Roxb.含有树脂的木材,全年均可采收［1］,通常在健康状态下并无分泌物产生,只有在受到自然或人工伤害后才会分泌多种次级代谢产物,经过复杂的结香过程后与木质部组织共同组成沉香［2］,主产于我国广东、广西、海南、云南、台湾等地,具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘的功效,临床上主要用于治疗胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急［3］。沉香中挥发油含有量较高,具有浓郁的香气,是其主要药效成分［4］,临床应用广泛,可保护消化系统、中枢神经系统等［5］。

沉香是珍贵药材,随着中医药发展对其需求量也日益增加,其提取工艺必然成为研究重点。目前,相关研究大多为沉香叶和种子中化学成分［6-8］、沉香挥发性成分药理活性［9］、沉香化学成分［10-13］；对于沉香精油的提取方法,已有水蒸气蒸馏、果胶酶预处理辅助提取、纤维素酶辅助提取、动态-微波辅助、溶剂回流提取、超临界CO2萃取法［14-19］,也有亚临界流体萃取［20］,但尚无应用1,1,1,2-四氟乙烷(R134a) 萃取沉香挥发油的报道。

本研究在单因素试验基础上,通过正交试验优化亚临界流体(R134a) 萃取沉香挥发油工艺,然后利用分子分离技术对其作进一步精制,得到挥发性、液体精制精油,并以GC-MS 法测定其含有量,为该药材质量控制及相关资源开发利用提供实验依据。

1 材料

1.1 试药 沉香收集于海南定安县下坡村,共3批,经中国科学院西北高原生物研究所高庆波副研究员鉴定为瑞香科植物沉香Aquilaria agallocha(Lour.)Roxb.含有树脂的木材。R134a(含有量99%) 购自西宁城西老史制冷配件批发部。无水乙醇为分析纯(天津市百世化工有限公司)；水为超纯水。

1.2 仪器 中试亚临界流体萃取装置(型号3×10 L+1 L,广州市浩立生物科技有限公司、华南理工大学联合研制)；一级沉香纯油专用分子分离设备(型号MDS-80a-I,广州市浩立生物科技有限公司)；数显恒温(玻璃) 水浴电动搅拌机(型号76-SH,上海达平仪器有限公司)；电子天平(型号ME403)、精密电子天平(型号AG135) (瑞士Mettler-Toledo 公司)；电热鼓风干燥箱(型号101-1,北京科伟永兴仪器有限公司)；超纯水机(型号UPE-Ⅱ-40 L,上海优普实业有限公司)。

2 方法

2.1 提取工艺优化 沉香含树脂部分阴干、粉碎后过40 目筛,置于50 ℃恒温干燥箱内干燥过夜,取出,装入密封袋中密封,置于干燥器中保存。取300 g,80%乙醇浸润后装入布袋中封口,置于亚临界流体萃取装置的萃取罐中,盖好压环及上堵头进行提取。在单因素试验基础上,以料液比(A)、提取压力(B)、提取温度(C)、提取时间(D)、夹带剂(乙醇) 体积分数(E) 为影响因素,沉香挥发油提取率为评价指标,正交试验优化提取工艺,平行3 次。

2.2 醇化和精油精制 将沉香挥发油置于醇化罐中进行升温醇化处理,至45 ℃时保持温度不变,继续搅拌醇化1 d,置于一级沉香纯油专用分子分离设备中进行不同阶段分子蒸馏。随着蒸馏温度逐渐增加,蒸馏压力逐渐减小,并在一定条件下接出馏分,以沉香投入量为对照计算各馏分含有量。

3 结果

3.1 单因素试验

3.1.1 料液比 称取沉香粉300 g,固定提取压力1.55 MPa,提取温度60 ℃,提取时间6 h,夹带剂80%乙醇(物料∶夹带剂＝2 ∶3),考察料液比1 ∶5、1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50 对沉香挥发油提取率的影响,结果见图1,可知提取率先提高后趋于平稳,但略有下降,在1 ∶30 时最高。溶剂量过少时,提取液达到饱和,导致提取不完全；溶剂量过多时,提取液提取需更长的时间,故选择1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40 进行考察。

图1 料液比对提取率的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate

3.1.2 提取压力 称取沉香粉300 g,固定料液比1 ∶30,提取温度60 ℃,提取时间6 h,夹带剂80%乙醇(物料∶夹带剂＝2 ∶3),考察提取压力0.80、 1.00、 1.20、 1.45、 1.50、 1.55、 1.60、1.65、1.80 MPa 对沉香挥发油提取率的影响,结果见图2,可知提取率先提高后略有降低,在1.55 MPa 时最高。随着提取压力升高,R134a 密度、溶解能力增加,从而使得提取率上升；但继续升高时,R134a 黏度变大,限制了沉香挥发油扩散速率,导致其提取率反而下降,故选择1.50、1.55、1.60 MPa 进行考察。

3.1.3 提取温度 称取沉香粉300 g,固定料液比1 ∶30,提取压力1.55 MPa,提取时间6 h,夹带剂80%乙醇(物料∶夹带剂＝2 ∶3),考察提取温度40、45、50、55、60、65、70、75 ℃对沉香挥发油提取率的影响,结果见图3,可知提取率先提高后降低,在60 ℃时最高。随着提取温度升高,溶质蒸气压增加,有利于提高其挥发性、传质速率、溶解度,从而使得提取率上升；但继续升高时,R134a 密度、溶解能力降低,导致提取能力反而下降,故选择55、60、65 ℃进行考察。

图2 提取压力对提取率的影响Fig.2 Effect of extraction pressure on extraction rate

图3 提取温度对提取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate

3.1.4 提取时间 称取沉香粉300 g,固定料液比1 ∶30,提取压力1.55 MPa,提取温度60 ℃,夹带剂80%乙醇(物料∶夹带剂＝2 ∶3),考察了提取时间1、1.5、2、3、4、6、8、10、12 h 对沉香挥发油提取率的影响,结果见图4,可知提取率逐渐增加,在6 h 时最高。随着提取时间延长,沉香挥发油逐渐减少,传质阻力逐渐下降,提取率增长程度不明显,故选择3、4、6 h 进行考察。

图4 提取时间对提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate

3.1.5 夹带剂 夹带剂可增加压力和温度对溶质在亚临界流体中溶解度变化的灵敏度,以达到更精密的分离要求,同时可降低亚临界流体操作压力或减少其用量。图5 显示,不同夹带剂下沉香挥发油提取率依次为甲醇＞乙醚＞乙醇＞乙酸乙酯＞丙酮,但加入甲醇后提取率仍低于80%乙醇,故选择75%、80%、85%乙醇进行考察。

图5 夹带剂种类对提取率的影响Fig.5 Effect of entrainer kind on extraction rate

称取沉香粉300 g,固定料液比1 ∶30,提取压力1.55 MPa,提取温度60 ℃,提取时间6 h,考察50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%乙醇(物料∶夹带剂＝2 ∶3) 对沉香挥发油提取率的影响,结果见图6,可知提取率逐渐增加,在80%时最高；但乙醇体积分数继续升高时提取率恒定,甚至略有降低。

图6 乙醇体积分数对提取率的影响Fig.6 Effect of ethanol concentration on extraction rate

3.2 正交试验 表1 显示,各因素影响程度依次为A ＞B ＞E ＞D ＞C, 从k 值分析, 最优工艺为A2B2C2D3E2,而正交试验中为A2B2C3D3E1,通过SPSS 19.0 软件分析可知因素C 对试验结果影响最小,故以其为误差,方差分析见表2。由表可知,因素A、B、D 对沉香挥发油提取率有显著影响(P＜0.05),而因素E 无显著影响(P＞0.05)。

表1 试验设计及结果Tab.1 Design and results of tests

表2 方差分析Tab.2 Analysis of variance

3.3 验证试验 对工艺A2B2C2D3E2进行验证试验,称取沉香粉300 g,平行3 批,得到深黄色、略带橙红色的油状液体,流动性差,带有醇厚的香气,并夹杂一丝腥味,置于2 ～8 ℃冰箱中冷藏时转变为蜡状固体, 提取率为3.77%, 优于工艺A2B2C3D3E1下测得的3.52%。由此确定,最优工艺为A2B2C2D3E2,即料液比1 ∶30,提取时间6 h,提取压力1.55 MPa,提取温度60 ℃,乙醇体积分数80%。

3.4 精制精油含有量测定 将“3.3” 项下优化工艺提取的沉香挥发油置于玻璃恒温水浴电动搅拌机醇化罐中,60 r/min 下搅拌,逐渐升温至45 ℃时保持温度不变,继续搅拌醇化1 d,再置于一级沉香纯油专用分子分离设备中,进行3 个阶段的分子蒸馏：在蒸馏温度50 ℃、蒸馏压力200 Pa 条件下,得到水分；在蒸馏温度70 ℃、蒸馏压力10 Pa条件下,得到挥发性精油,其颜色呈明黄色,又略带有红色,流动性较差,具有沉香特有的浓郁醇厚香气,并兼具凉意,气味丰富饱满,层次分明,其组成和含有量见表3；在蒸馏温度80 ℃、蒸馏压力1 Pa 条件下,得到液体精油,其颜色呈黄色,又略带有红褐色,流动性差,带有沉香特有的香气,但气味比挥发性精油淡,其组成和含有量见表4。由此可知,挥发性、液体精油含有量分别为1.45%、0.867%,说明沉香精油中主要以挥发性成分为主。

表3 挥发性精油组成和含有量（n=3）Tab.3 Compositions and contents of volatile essential oils（n=3）

表4 液体精油组成和含有量（n=3）Tab.4 Compositions and contents of liquid essential oils（n=3）

4 讨论和结论

目前,沉香精油的提取方法有水蒸气蒸馏、果胶酶预处理辅助提取、纤维素酶辅助提取、动态-微波辅助、溶剂回流提取、超临界CO2萃取等,其中水蒸气蒸馏提取率低,萃取挥发油仅为沸点较低的小分子；酶辅助提取对温度、能耐受pH 值、酶本身活力要求比较高；微波萃取时挥发性成分随着萃取时间的延长而逐步散失；溶剂回流提取后有溶剂残留,并且回收繁琐费时；超临界CO2提取工艺简单,但萃取装置属于高压设备,投资费用昂贵；亚临界流体萃取溶剂残留少,不会对物料中的热敏性成分造成损害,克服了传统工艺不足,在保留超临界流体萃取优点的同时溶剂选择面大、物料广泛,无污染,提取效率高,运行成本低,条件温和,易与产物分离,并且不需要高压设备,提取量大,在液态和临界点附近具有良好的溶剂性能,尤其适合天然原料萃取,在医药、保健品领域具有良好的应用前景［21-22］。本实验采用亚临界流体［1,1,1,2-四氟乙烷(R134a) ］ 萃取沉香挥发油,发现该方法对挥发油这类极性较小的成分具有良好的选择性和较高的萃取率。

虽然经本实验优化工艺所得沉香提取物的气味立体逼真,但仍然存在酸味、杂气过重等问题,需进一步除酸,并将提取过程中引入的溶剂蒸出来,即进行醇化处理。其中,醇化温度是沉香醇化过程中最好的催化剂,本实验发现当温度升高至45 ℃以上时低分子挥发油被逐渐蒸出,对香料气味至关重要,并且温度过高会改变沉香气味,导致其难闻,直接影响药材品质。时间是影响沉香醇化的另一个重要因素,醇化时间越长,药材味道、品相越理想,但醇化超过24 h 后提取物颜色明显变深,由原来黄色、略带橙红色变为红褐色,品相变差,故最终确定在45 ℃下持续搅拌1 d 进行醇化。

然后,对挥发性、液体沉香精油进行GC-MS分析。表3 显示,前者中6,7-二甲基-2-苯乙基色酮为色酮类成分,4-苯基-2-丁酮(苄基丙酮)、4,6-二-(1.1-二甲基乙基) -2-甲基-苯酚、1,5-二苯基-1-戊烯-3-酮为芳香族类成分,斯巴醇(桉油烯醇)、白檀油烯醇、异香橙烯环氧化物、表-γ-桉叶油醇、沉香螺萜醇、马兜铃烯、愈创醇、α-桉叶油醇、α-白檀油醇、异白木香醇等为倍半萜类成分,棕榈酸甲酯、亚油酸乙酯等为脂肪酸酯类成分,上述成分占总量的49.41%,其中愈创木醇、沉香螺萜醇、苄基丙酮等为沉香特征制香成分,占总量的14.65%；表4 显示,后者中6,7-二甲基-2-苯乙基色酮为色酮类成分,4-苯基-2-丁酮(苄基丙酮)、4,6-二-(1.1-二甲基乙基) -2-甲基-苯酚为芳香族类成分,斯巴醇(桉油烯醇)、异香橙烯环氧化物、表-γ-桉叶油醇、沉香螺萜醇、β-桉叶醇、异白木香醇等为倍半萜类成分,棕榈酸甲酯、亚油酸乙酯等为脂肪酸酯类成分,上述成分占总量的36.69%,其中愈创木烯、沉香螺萜醇、苄基丙酮等为沉香特征制香成分,占总量的6.51%。