基于超高效液相色谱法快速测定短链脂肪酸方法的建立

陈和地，任怡琳，耿 燕，许正宏

(1.江南大学药学院，江苏无锡214122；2.江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122；3.江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡214122)

近年来，随着基因文库的构建及测序手段的革新，肠道微生物在各类疾病中扮演的重要角色也被人熟知。肠道微生物主要通过改变肠屏障功能、分泌代谢产物、改变肠黏膜通透性等途径维持肠道微生态的稳定及机体的健康[1]。随着人们对肠道微生物研究的深入，高通量测序、PCR-DGGE技术、RT-PCR技术都被广泛地应用于肠道微生物菌群结构的探究之中。同时，肠道微生物通过代谢各类膳食纤维、脂类等物质后产生各种小分子代谢产物，在这些代谢产物中，短链脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)的产生、吸收及进一步代谢愈来愈受到人们的关注。SCFAs是碳链不长于6的有机酸，是肠道微生物参与宿主代谢的主要代谢产物，包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸和异己酸等[2]。SCFAs是结肠及小肠上皮细胞能量物质[3]，可调控肠道表面pH，以维持肠道内酸碱平衡[4]。SCFAs还可改善体内炎性疾病(如饮食诱导的肥胖小鼠的结肠炎)/呼吸道疾病和代谢综合征甚至结肠癌症[5-6]。随着SCFAs在修复肠黏膜及促进癌细胞分化与凋亡等方面的作用[7]被发现，建立快速、全面地检测SCFAs的方法用于食品成分分析、评价不同食品摄入对机体的益生作用等具有重要意义。Ewaschuk等[8]发现，通过检测生物基质中SCFAs的变化可以反映出机体体内厌氧菌的变化。因此，检测复杂样品(如粪便、发酵液、酒类和果蔬类等)中SCFAs的种类及其分布情况，在检测微环境中相关菌群代谢变化、评估机体健康、筛选高产酸菌株以及评价样品益生效果等方面都有十分重要的应用。

SCFAs的测定方法早期测定采用滴定法，该法特异性不强、准确度差。随着色谱技术的快速发展，气相色谱、高效液相色谱(HPLC)及毛细管色谱等方法已经广泛应用于SCFAs的测定。但SCFAs极性大、挥发性强及其来源的生物样品的复杂性也为其准确定量增加了难度。为了快速了解样品中SCFAs的变化，张萍等[9]采用反相梯度高效液相色谱技术在30 min内完成了甲酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、丙酸、丁酸和戊酸7种有机酸的分离；刘娟等[10]采用离子排斥色谱法在25 min内对乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸和异戊酸实现了分离；Gardana等[11]通过UHPLC-HR-MS法成功地在30 min内完成对包含戊酸在内的9种SCFAs进行检测。这些方法虽然都得到了应用，但单次分析所耗时间较长且所测SCFAs种类偏少，考虑到SCFAs的不稳定性，不利于大批量分析。因此，如何快速全面地分析样品中SCFAs的含量显得十分重要。

超高效液相色谱法(UPLC)与传统的HPLC方法相比，有高分离度、高灵敏度及高速率等优点。应用UPLC方法可有效提高分析物的分离效果及分离所需时间，对代谢组学分析及其他领域的发展均有较大的促进作用。本文中，笔者建立UPLC方法，快速检测粪便和肠道微生物体外发酵液中SCFAs含量，并对该方法进行验证，以期用于评价动物模型的肠道健康及检测粪便体外厌氧发酵液SCFAs的变化情况。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

LC-30AD型超高效液相色谱仪、InertSustain AQ-C18色谱柱，Shimadzu公司。

甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸、2-乙基丁酸、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸、正己酸、戊二酸及己二酸，上海麦克林生化科技有限公司；乙腈为HPLC级、实验用其他试剂均为分析级，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱为InertSustain AQ-C18(150 mm×2.1 mm,1.9 μm)，流速0.5 mL/min，检测波长210 nm，柱温40 ℃，进样量10 μL；流动相为20 mmol/L NaH2PO4(用磷酸调节pH至2.2)与乙腈混合液。

1.2.2 样品准备

1)发酵液取样、保存及预处理。取接种粪便微生物体外培养的发酵液，于1 000 r/min离心5 min，吸取上清至新的2 mL离心管中，于12 000 r/min离心5 min，吸取上清至新的2 mL离心管中，置于4 ℃下避光保存，等待预处理。

取1 mL发酵上清液，加入100 μL浓盐酸后充分振荡混匀，加入2 mL无水乙醚萃取20 min，于3 000 r/min离心5 min后取上清液，加入500 μL 1.0 mol/L NaOH萃取20 min，3 000 r/min离心5 min后取下层水相，加入100 μL浓盐酸，0.22 μm水膜过滤后转入液相瓶中待测[12-13]。

2)粪便取样、保存及预处理。抓取适合周龄小鼠，取适量粪便，于-80 ℃冻存待测。取适量粪便(>50 mg)，按10 mL/g加入25%偏磷酸溶液，充分振荡使其成匀浆态，静置30 min，于4 ℃、12 000 r/min离心20 min，吸取上清，0.22 μm水膜过滤后转入液相瓶中待测[14]。

3)白酒、果汁预处理。取1 mL样品，加入0.4 mL亚铁氰化钾(106 g/L)，0.4 mL硫酸锌溶液(300 g/L)，振荡混匀，12 000 r/min离心5 min，吸取上清过0.22 μm水膜过滤后转入液相瓶中待测。

1.2.3 标准品的配制

取适量标准品原液配制标准品储备溶液(100 mmol/L),于4 ℃暂存。将含甲酸、乙酸、丙酸、正丁酸、异戊酸、正戊酸、4-甲基戊酸、3-甲基戊酸、正戊酸、戊二酸及己二酸的标准品储备溶液(100 mmol/L)用超纯水分别稀释为100、50、25、10、5及2.5 mmol/L的混合标准品系列溶液。

1.2.4 线性关系

取不同浓度的混合标准品按优化好的条件进行检测，将各SCFAs的峰面积(Y)与浓度(X)进行线性评价。

1.2.5 回收率和精密度

将未检出分析物的空白培养基配制为4种不同浓度的加标样品(75.0、50.0、5.0及2.5 mmol/L)，各浓度做5次平行实验，评价回收率及精密度。

将已知SCFAs的粪便样品配制为4种不同浓度的加标样品(75.0、50.0、5.0及2.5 mmol/L)，各浓度做5次平行实验，评价回收率及精密度。

1.2.6 气相色谱法检测SCFAs含量

气相色谱条件参照文献[15]，色谱柱为DB-WAX 30M (0.32 mm，5 μm)，进样口温度为250 ℃，检测器温度为250 ℃,程序升温(50 ℃保持3 min后，以6 ℃/min的速率升温至120 ℃，保持0.5 min后以6 ℃/min的速率升温至220 ℃，保持5 min)，N2流量为3 mL/min，H2流量为47 mL/min，空气流量为400 mL/min，分流比为1∶ 3，进样量为1.0 μL。

利用气相色谱法及建立的UPLC方法对同一混合标准品进行分析，对2种方法在保留时间、SCFAs的检出数量等方面进行比较，以考察UPLC法检测的优越性。

2 结果与讨论

2.1 UPLC方法的确定

对粪便及发酵液中SCFAs的测定方法已有相关文献报道[2,11]，多采用气相色谱法进行探究，主要针对乙酸、丙酸和丁酸等几种主要SCFAs进行分析，而全面地对大部分含量较少但作用不可忽视的有机酸研究则较少。通过对梯度洗脱程序的优化，同时兼顾样品的分离度及保留时间，在0.5 mL/min流速下最优的梯度洗脱条件如表1所示。

表1 SCFAs分析的UPLC洗脱程序

由表1可知，样品检测程序仅需10 min，在该条件下，各SCFAs均能较好地分离。色谱图如图1所示。

2.2 SCFAs标准曲线的确定

采用外标法，以11种SCFAs的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，结果如表2所示。

由表2可知：各SCFAs浓度为2.5～100 mmol/L时呈现较好的线性，回归系数均高于0.999，可用于定量分析。所测定的相关系数(R2)及仪器检出限(LOD，S/N=3),定量限(LOQ，S/N=10)见表2。

2.3 方法验证

由于生物基质的复杂性，需要对建立方法进行加标回收率及精密度的检测。以1.2.5节的方法用不同浓度(75.0、25.0、2.5和1.0 mmol/L)的11种SCFAs对粪便及空白培养基进行加标回收率及精密度评价，结果如表3所示。

由表3可知：加标培养基中各SCFAs回收率为95.15%～107.01%，精密度为0.58%～7.33%，加标粪便样本中各SCFAs回收率为98.43%～105.14%，精密度为1.13%～5.20%。说明本方法有较好的准确度与精密度，可用于粪便及接种粪便微生物体外发酵所得发酵液中SCFAs的测定。

2.4 UPLC法与常用气相色谱检测法对比

将所建立UPLC法与常用气相色谱法对统一样品进行对比，色谱图如图2所示。

由图2可知：气相色谱法可以检测出7种SCFAs，这些SCFAs的出峰时间主要集中于10～20 min；未检出的SCFAs中，甲酸是较难检测的有机酸，戊二酸及己二酸则是由于他们的沸点较高，己酸的出峰时间滞后，需要较长的检测时间才出峰。而UPLC方法可在10 min内快速检测11种SCFAs，能快速全面地对样品中SCFAs含量进行准确定量。

1—甲酸；2—乙酸；3—戊二酸；4—丙酸；5—己二酸；6—正丁酸；7—异戊酸；8—正戊酸；9—3-甲基戊酸；10—4-甲基戊酸；11—正己酸；IS—2-乙基丁酸图1 粪便与发酵液及其相应加标溶液色谱图Fig.1 Chromatograms of fermentation broth,feces and their spiked samples

表2 11种SCFAs的保留时间、线性范围、相关系数、定量限及检测限

Table 2 Retention time,linear ranges,correlation coefficients,detection limits,quantitative limits of SCFAs

组分保留时间/min线性范围/(mmol·L-1)相关系数定量限/(mmol·L-1)检测限/(mmol·L-1)甲酸0.943 8±0.0192.5～1000.999 90.760.25乙酸1.250 7±0.0112.5～1000.999 90.800.27戊二酸2.045 8±0.0242.5～1000.999 90.330.11丙酸2.251 5±0.0322.5～1000.999 80.810.27己二酸3.020 5±0.0172.5～1000.999 00.330.11正丁酸3.923 8±0.0192.5～1000.999 40.860.28异戊酸5.590 8±0.0072.5～1000.999 70.730.24正戊酸5.876 0±0.0102.5～1000.999 70.730.243甲基戊酸7.648 0±0.0152.5～1000.999 81.220.404甲基戊酸7.964 2±0.0452.5～1000.999 51.300.43正己酸8.440 0±0.0132.5～1000.999 51.550.51

表3 UPLC分析样品中SCFAs的准确度与精密度

1—甲酸；2—乙酸；3—戊二酸；4—丙酸；5—己二酸；6—正丁酸；7—异戊酸；8—正戊酸；9—3-甲基戊酸；10—4-甲基戊酸；11—正己酸；IS—2-乙基丁酸图2 不同方法SCFAs色谱图对比Fig.2 Chromatograms of short chain fatty acid by different chromatography methods

2.5 UPLC法测量发酵液及小鼠粪便中SCFAs分布

肠道微生物在宿主肠道中能利用碳水化合物、膳食纤维、脂肪酸等物质进行厌氧代谢，产生利于机体健康的小分子代谢产物。通过建立的方法可全面地比较不同疾病小鼠粪便中SCFAs的差异，进而寻找与疾病相关的关键代谢物。此外，对肠道微生物体外发酵液测量SCFAs可用于筛选肠道菌群中产酸能力较强的菌株，对体外筛选菌株有较大的帮助。

根据1.2.2节的方法对粪便及发酵液样品进行预处理，再利用1.2.6节方法进行UPLC检测，样品中各SCFAs含量如表4所示。同时对白酒及苹果汁样品进行简单的除蛋白步骤，应用文中所示方法进行检测，结果见表4。

由表4可知：在人、大鼠及小鼠的粪便中，乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸及正戊酸都有明显的差异，表明不同宿主肠道微生物产生有机酸的能力有较大差异。糖尿病小鼠及高脂肥胖小鼠粪便SCFAs的含量差异也表明宿主在疾病状态下，肠道中SCFAs会发生显著性变化，影响宿主代谢。通过检测粪便微生物体外发酵液中SCFAs的增加，可推测出产乙酸、丁酸微生物的富集时间。通过检测发酵液中SCFAs含量，可确定各菌株的生长周期，以提供体外筛选产酸菌株的最佳时间。此外，在白酒与苹果汁样本中应用本方法也能快速检测相应的SCFAs含量，体现出本方法良好的应用前景，对白酒酿造及果汁发酵过程中有机酸的检测提供一定帮助。

表4 不同样品中SCFAs分布情况

3 结论

本方法可用于快速、全面、准确地检测粪便或发酵液中11种有机酸(甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、正戊酸、异戊酸、戊二酸、己二酸、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸及正己酸)的含量。样品预处理程序主要利用液-液萃取法，无衍生化步骤，UPLC运行时间为10 min，经验证其线性、精度、准确度、LOD和LOQ均处在指定范围。因此，本方法可用于机体肠道代谢物的评价、体外厌氧菌群的筛选，还可用于酒类和果蔬中有机酸的检测。