利用四甲基氢氧化铵提取小麦秸秆木质素及其结构表征

程 芳，朱瀛奎，钟 超，贾红华，曹 飞，周 华，韦 萍,文 飞

(1．南京工业大学生物与制药工程学院，江苏南京211800; 2．上海康地恩生物科技有限公司，上海201210)

木质素(lignin)是构成植物细胞外壁的主要物质，在木本植物中，其含量一般为20%～25%。木质素对于人类可持续发展的重大贡献在于能够提供稳定的、持续的有机物来源，更是可再生资源中仅有的可用于生产芳香类物质的非石油资源[1]。因此，木质素的应用前景十分广阔，其衍生物具有多种特性，可作为分散剂、吸附剂、水泥减水剂和沥青乳化剂等[2]。

通常情况下，组织细胞中的木质素与半纤维素共价结合并紧密包裹着纤维素组分，这种结构常导致分离木质素中残留少量半纤维素等杂质，所以木质素整体分离效率不高。解决木质纤维素组分(尤其是半纤维素与木质素)间的交互作用是实现各组分高效分离的重要前提。

目前，国内外比较成熟的生物质木质素分离方法主要为酸法、碱法、有机溶剂法和离子液体法。酸法提取木质素，主要通过浓酸来降解木质纤维素中的碳水化合物，从而得到木质素。但近年来，许多人开始利用有机酸进行木质素提取研究，如Zhou 等[3]利用微波加热辅助甲酸提取木质素，结果发现，该法提取的木质素产量要远远高于油浴加热辅助法提取的产量；Li等[4]利用微波辅助有机酸提取的木质素具有很好的抗氧化性，这种木质素在食品工业中得到广泛的应用。碱法提取木质素是目前工业上应用最为广泛的提取方法[5-6]。根据生物质原料的不同，选择的碱也不相同，碱法提取的木质素具有很高的工业价值。有机溶剂法提取木质素作为一种新型低污染处理方法已被广泛接受。如Fogarassy等[7]利用乙醇作溶剂，以NaHSO3作催化剂，在高温下蒸煮，可将原料中的木质素完全提取；Black等[8]利用乙醇和丙酮的复合有机溶剂，以少量酸作催化剂可以提取出高纯度的木质素。与其他溶剂相比，离子液体具有蒸汽压低、溶解力强、热稳定性好和理化性质可调等优点。如Tan等[9]利用[C2mim][ABS]在 170～190 ℃、常压、120 min的条件下处理甘蔗渣，木质素的提取率可达93% ；Liu等[10]发现由胆碱阳离子和氨基酸阴离子组成的生物基离子液体对木质素具有很好的溶解性。

在提取木质素工艺中，不同方法及分离条件会导致木质素结构单元之间的连接键型和功能基团的差异，进而导致提取率的不同。如何获得高活性木质素提取率是研究的关键。

本研究中，笔者利用四甲基氢氧化铵(TMAH)提取小麦秸秆木质素，用凝胶渗透色谱仪(GPC)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、紫外可见光谱(UV-Vis)和核磁共振氢谱分析(1H NMR)对木质素进行结构表征和理化特性分析，对TMAH浓度、温度、时间以及固液比对小麦秸秆木质素提取率影响的关键因素进行优化，以提高小麦秸秆中木质素总脱除率，以期为小麦秸秆木质素应用提供指导。

1 材料与方法

1.1 原料与设备

小麦秸秆原料，河南省郑州市中牟县官渡镇宋庄，清洗烘干后用粉碎机粉碎。标准碱木质素，山东高唐利亚科技有限公司；四甲基氢氧化铵(TMAH，250 g/L水溶液)，阿拉丁试剂公司；其他试剂为市售化学纯或分析纯。

Nicolet 380型傅里叶变换红外光谱仪，美国尼高力仪器公司；AVANCE III HD型核磁共振谱仪，美国Bruker公司；Genesys 10S型紫外可见(UV-Vis)分光光度计，美国Thermo公司；HLC-8320GPC型凝胶渗透色谱仪，东曹上海科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小麦秸秆化学组成分析

将清洗过的小麦秸秆于烘箱中干燥，粉碎过筛(粒径0.85 mm)，取20 g小麦秸秆原料，按照美国国家可再生能源实验室的测定方法[11]，测定小麦秸秆的化学组分。

1.2.2 小麦秸秆木质素的分离工艺

取适量已烘干的小麦秸秆原料，放入烧瓶中，加入一定浓度的TMAH水溶液，水浴加热，然后趁热真空抽滤，滤液倒入烧杯中，加入6 mol/L的乙酸调pH至5.5，减压浓缩，浓缩液用3倍其体积的95%乙醇处理后静置，待沉淀完全后过滤，滤液浓缩除去乙醇后加入盐酸搅拌，调节pH至3左右，约70 ℃保温凝集，静置过夜，倾倒出烧杯中的上层清液，再离心分离，然后水洗3次，冷冻干燥，所得产品为小麦秸秆木质素。

1.2.3 正交试验优化工艺条件

在单因素试验的基础上，以木质素提取率为指标，选取TMAH浓度、固液比、时间和温度这4个因素进行正交试验优化，试验因素和水平见表1。

1.2.4 TMAH水溶液的循环使用性分析

四甲基氢氧化铵的循环性研究是在木质素提取单因素实验所得最优化条件下进行的。在木质素提取过程中，所收集的所有滤液利用旋转蒸发仪在0.1 MPa、48 ℃条件下对滤液进行减压浓缩，通过蒸发浓缩可获得高浓度的TMAH水溶液，并以此配制250 g/L的溶液用于下一轮的木质素分离提取的溶剂。在循环实验中，TMAH水溶液的浓度利用高效液相色谱进行检测，并以此计算溶剂回收率。

1.3 小麦秸秆木质素的结构表征

1.3.1 木质素分子量测定

分离木质素分子量的测定采用凝胶渗透色谱仪(GPC)进行分析，色谱柱采用PL gel 10 μm MIXED-B(安捷伦科技(中国)有限公司)。准确称取4.0 mg乙酰化木质素样品溶解在2 mL色谱四氢呋喃(THF)中，溶解后液体采用0.45 μm滤头过滤进色谱柱进行分析[12]，进样量为50 μL。

1.3.2 紫外可见光谱(UV-Vis)测定

采用UV-Vis分光光度计测定。按照固液比为1∶ 20 g/mL，将分离木质素和标准木质素样品溶解于二甲基亚砜(DMSO)中配制成样品溶液，随后将1 mL待测溶液加入1 cm光径的石英比色皿中，利用紫外分光光度计对溶液进行全波长扫描，以二甲基亚砜作为参比液，比较2种样品的特征吸收峰位置，扫描范围200～350 nm。

1.3.3 傅里叶变换红外光谱(FT-IR)测定

采用傅里叶变换红外光谱仪测定。分离物质和标准木质素样品干燥研磨后用KBr压片(m(木质素)∶m(KBr)=1∶ 100)，KBr做背景扫描；分辨率为4 cm-1，扫描范围为3 750～750 cm-1；扫描次数32次。

1.3.4 核磁共振氢谱(1H NMR)分析

以CDCl3为溶剂配制质量浓度为20 g/L的乙酰化木质素溶液，其中乙酰化木质素是参照文献[13]中的方法制备，将待测溶液加入5 mm核磁检测管，以四甲基硅烷(TMS)做内标，通过核磁共振谱仪进行1H NMR检测。豫驰时间1.5 s，采样时间0.17 s。

2 结果与讨论

2.1 小麦秸秆化学组成分析结果

小麦秸秆化学组成分析结果见表2。由表2可知：小麦秸秆中纤维素和半纤维素为主要成分，但木质素的质量分数为14.8%。

表2 小麦秸秆的化学组分(绝干原料)

2.2 木质素提取的单因素试验

2.2.1 温度对木质素提取率的影响

温度是控制化学反应速率和方向的重要因素。在TMAH质量浓度为250 g/L、时间14 h、固液比为1∶ 14 g/mL的条件下，考察温度对木质素提取率的影响，结果见图1。

图1 温度对木质素提取率影响Fig.1 Effect of temperature on the yield of isolated lignin

由图1可知：当温度为50 ℃时，木质素的提取率为77.4%，适当地升温有利于破坏木质素的网状结构，但是温度过高，木质素的提取率反而越低。可能是由于高温时大量纤维素溶解，从而影响了木质素的溶出。通过对过滤剩余的秸秆进行检测，发现秸秆中有15%左右的木质素未被提取出来，因此温度在50 ℃时为宜。

2.2.2 时间对木质素提取率的影响

在温度50 ℃、TMAH质量浓度250 g/L、固液比为1∶ 14 g/mL时，考察时间对木质素提取率的影响，结果见图2。

图2 时间对木质素提取率影响Fig.2 Effect of time on the yield of isolated lignin

由图2可知：木质素的提取率随着时间的增加而增加，当时间为14 h时，木质素的提取率为77.5%，随着时间的增加，趋于平缓，提取基本结束。

研究发现，TMAH水溶液处理秸秆时间过短，提取的产物中木质素的纯度较低，处理时间越长木质素的纯度越高。可能是由于短时间地处理木质素未完全溶出而较长的TMAH处理时间有利于小麦秸秆木质素的溶出，因此时间以14 h为宜。

2.2.3 固液比对木质素提取率的影响

在温度50 ℃、时间14 h、TMAH质量浓度为250 g/L的条件下，考察固液比对小麦秸秆中木质素提取率的影响，结果见图3。

图3 固液比对木质素提取率的影响Fig.3 Effect of solid to liquid ratio onthe yield of isolated lignin

由图3可知，当固液比为1∶ 14 g/mL时，木质素的提取率为79.9%。研究发现，过量的季铵碱溶液处理秸秆，提取得到的产物木质素纯度也较低，可能是由于过量的季铵碱溶液的处理使纤维组分发生溶解而影响了木质素的提取，因此木质素提取的固液比1∶ 14 g/mL为宜。

2.2.4 TMAH浓度对木质素提取率的影响

木质素通过酯键与半纤维素连接，经过TMAH水溶液预处理将酯链断裂，从而实现木质素的分离。在温度50 ℃、时间14 h、固液比为1∶ 14g/mL的条件下，考察TMAH质量浓度对小麦秸秆中木质素提取率的影响，结果见图4。

图4 TMAH浓度对木质素提取率的影响Fig.4 Effect of TMAH concentration on theyield of isolated lignin

由图4可知，木质素的提取率随着TMAH质量浓度的增加而增加，TMAH质量浓度为240 g/L时，木质素的提取率为78.9%，使用低浓度的季铵碱溶液可以避免在处理过程中纤维组分发生溶解。因此，TMAH质量浓度240 g/L为宜。

2.3 正交试验结果

2.3.1 正交试验法筛选提取工艺

通过9种试验方案分离得到木质素干制品，利用Klason木质素法测分离木质素的纯度，计算木质素的提取率，正交试验结果见表3，方差分析见表4。

表3 L9(34)正交试验结果

表4 方差分析表

由表3分析可知，四甲基氢氧化铵提取小麦秸秆木质素影响因素为B、A、C、D，最佳工艺组合是A2B2C3D2，即提取温度50 ℃、提取时间14 h、固液比1∶ 14 g/mL、TMAH质量浓度250 g/L。在最佳工艺条件下的木质素提取的验证试验得到的小麦秸秆木质素的提取率为79.9%。

2.3.2 TMAH水溶液的回收利用

四甲基氢氧化铵在木质素分离提取过程中的循环性实验结果如表5所示。

由表5可知，随着溶剂循环次数的增加，木质素的分离效率呈现逐渐降低的趋势，经过5次循环使用，溶剂回收率保持在85%以上，分离木质素纯度比第一轮分离物质降低了17%，这可能是由于多次循环使用造成溶剂中的杂质(芳香类物质、纤维糖等)逐渐积累，使得部分OH-发生钝化所致。同时，再生过程中的溶剂分解以及操作导致的溶剂损失都将会影响溶剂的循环使用性能。本研究利用四甲基氢氧化铵提取小麦秸秆木质素条件温和，木质素提取率和纯度均较高，避免了传统方法对原料中木质素的结构影响及木质素的溶出损失。

表5 木质素分离提取中TMAH循环使用

2.4 木质素结构表征结果分析

2.4.1 分子量分布

为了表征季铵碱分离得到的碱木质素的分子量的特点，采用凝胶渗透色谱法(GPC)对分离得到的木质素组分的分子量进行分析，结果见图5。木质素组分的重均分子量(Mw)和数均分子(Mn)和多分散性指数(Mw/Mn,表征分子量分布的宽度)。

由图5可以发现，四甲基氢氧化铵分离得到的木质素样品的分子量为1 420 g/mol，比麦草秸秆原料提取的磨木木质素分子量(7 500 g/mol)低[14]，说明季铵碱提取小麦木质素会使木质素发生降解，体系中获得的相对高得率和高纯度的木质素为低聚片段。

多分散系数Mw/Mn表示分子量的均一程度，分散系数越小，表示提取的木质素分子比较均一。值得注意的是，此方法得到的木质素分子的多分散系数很小(接近1.0)，说明季铵碱提取的小麦秸秆木质素分子量分布均一，有利于对其进行加工利用。

图5 分离木质素的分子量分布Fig.5 GPC curve of the isolated lignin

2.4.2 红外光谱(FT-IR)分析结果

采用红外光谱对分离物质及标准碱性木质素样品进行红外光谱分析，结果见图6。

图6 标准木质素及分离木质素FT-IR红外光谱图Fig.6 FT-IR analysis of the standard ligninand isolated lignin

2.4.3 紫外可见光谱(UV-Vis)分析结果

通过对分离物质和标准木质素的紫外光谱分析，结果见图7。

图7 标准木质素及分离木质素紫外光谱图Fig.7 UV analyses of the standard ligninand isolated lignin

由图7可知：2种物质展现的紫外吸收特征峰的位置基本相同，波长在280～290 nm以及260 nm处均出现明显的吸收峰[17]，其中波长位于280～290 nm的吸收峰源于木质素中的非共轭酚羟基(即典型愈创木基G)；而波长在260 nm处的吸收峰则为木质素苯环的特征吸收峰，这两处吸收峰均为木质素的特征紫外吸收峰。同时，分离物质与标准木质素的吸收峰强度也极为接近，间接表明分离物质中含有高纯度的木质素组分，杂质含量较少；同时也表明分离再生过程中木质素功能结构保持较为完整[18]。

2.4.4 核磁共振氢谱(1H NMR)分析结果

为了进一步探究分离物质的结构官能团性质，研究以CDCl3为溶剂对分离物质进行1HNMR检测，结果见图8。

结合文献[19]和图5分析可知：δ=8.0～6.1的信号能直接提供木质素芳环的取代信息，δ=7.40～8.00处是对羟苯基的质子信号。其中化学位移δ=7.26 处的强峰源于溶剂CDCl3的吸收信号，δ=6.70～7.40是愈创木基的质子信号。通过1H NMR图谱还能看出，δ=3.75处的峰较强，该信号是由甲氧基中的H原子产生的信号，属于分离物中芳香环上的甲氧基；δ=2.0～2.5 处的强峰为木质素羟基中H原子产生的信号，δ=0.8～2.0为脂肪族上的质子信号。结果表明提取木质素基本保持完整的木质素功能结构。

图8 分离木质素的1H NMR分析图谱Fig.8 1H NMR analysis of the isolated lignin

3 结论

利用季铵碱溶剂对生物质原料木质素进行分离提取，并对分离木质素进行结构性质分析。在单因素试验的基础上，通过正交试验得到最佳提取优化条件：TMAH质量浓度250 g/L 、时间14 h、温度50 ℃，固液比1∶ 14(g/mL)，木质素的提取率达到79.9%。

通过红外光谱分析及核磁氢谱分析结果可知，分离木质素含有H-G-S型木质素的结构特征。紫外可见光谱分析发现分离木质素在波长280～290 nm以及260 nm处均出现明显的吸收峰，其中280～290 nm的吸收峰源于木质素中的非共轭酚羟基(即典型愈创木基G)，而波长在260 nm处的吸收峰则为木质素苯环的特征吸收峰，说明分离再生过程中木质素功能结构保持较为完整。

本研究利用低浓度的季铵碱溶剂对生物质原料进行处理，可以实现木质素组分的高效分离，所分离的木质素结构保持较为完整，这将为木质素利用技术的开发提供新的思路。