植物乳杆菌对辣白菜发酵过程中风味物质及菌群结构的影响

任大勇，高良锋，杨柳，刘宏妍，于寒松，沈明浩

1(吉林农业大学 食品科学与工程学院，吉林 长春，130118) 2(吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春，130118)

辣白菜是我国北方地区传统泡菜的一种，属于乳酸菌低温发酵食品，与其他发酵蔬菜相似，微生物的代谢不仅赋予辣白菜丰富的营养物质[1-2]，同时还产生了独特的风味[3-4]。这些风味主要包括滋味物质(有机酸，氨基酸，糖类等)和香气物质(挥发性有机酸，醇类，酯类，芳香族化合物等)[5-6]。经过臭氧灭菌处理的原料发酵得到的辣白菜在风味和安全性方面往往不被消费者所接受[7]，所以辣白菜的加工过程普遍采用原始生料，发酵过程利用白菜及配料自身携带的微生物来完成[8-9]，这样丰富的代谢产物和复杂的微生物之间同样也会相互影响，因此目前还没能找到一种合理的方式来控制整个辣白菜的发酵过程中微生物和代谢产物的变化。

接种发酵通常采用单菌株或多菌株复合作为发酵剂，能达到缩短辣白菜发酵时间，延长保质期，改变风味等目的，是目前发酵蔬菜行业中公认的有效手段[10-11]。我国对辣白菜发酵剂的研究较少，韩国对于辣白菜发酵剂的研究较为成熟，已有Leuconostoc.citreumGJ7、Lactobacillus.plantarumPL62及Leuconostoc.mesenteroidesLK93等[12-14]发酵剂。研究表明辣白菜发酵过程中的优势菌种主要包括明串珠菌、乳杆菌、以及魏斯氏菌[15-16]。关于发酵剂对风味的影响针对于明串珠菌的研究较多，但关于同样在发酵过程中起到重要作用的乳杆菌对于风味的贡献研究却较少。

乳杆菌是辣白菜发酵中后期的优势菌属之一，这些乳杆菌主要包括植物乳杆菌和沙克乳酸杆菌，但沙克乳酸杆菌很少能从辣白菜中分离出来，相比植物乳杆菌分离培养更加广泛[17-18]。所以，本研究以前期筛选分离的耐盐、耐低温植物乳杆菌作为发酵剂；通过在辣白菜发酵前，投入该菌株，研究该菌株对于辣白菜发酵过程中微生物的变化，以及对可滴定酸、氨基酸、可溶性糖以及挥发性风味物质的影响，为辣白菜发酵剂的开发和辣白菜的品质控制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌株:植物乳杆菌L12；大白菜(结球白菜)、辣椒粉、大蒜、姜、食盐、白糖等;市售:NaOH、甲醛、HCl、CuSO4、酒石酸钾钠、乙酸锌、冰醋酸、亚铁氰化钾(分析纯)：北京化工厂；亚甲基蓝(指示剂)：北京益利；MRS肉汤培养基：青岛海博。

1.2 仪器与设备

PHS-3C pH计，上海佑科仪器仪表有限公司；5804R离心机，Eppendorf；BSA2245-CW电子天平，Sartorus；电加热套、6890N—5975C气相色谱—质谱联用仪，安捷伦科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 辣白菜样品制备

去老叶→切分→称重→腌制→清洗→抹料→发酵→保藏

将新鲜白菜去老叶，切分成4瓣，以质量为基重，用4% (质量分数)食盐腌制24 h，用清水清洗，沥干，待用。用适量的热水烫辣椒粉去苦，冷却。将苹果、梨、姜、蒜用捣碎机打碎成泥状，按配料比例调制成辣白菜酱料，按每份占白菜总质量的百分数分配酱料，根据原料质量加入2%菌悬液(自然发酵组加入等量生理盐水)，混匀。将酱料均匀涂抹在每一片菜叶，放在塑料保鲜盒中密封，于10 ℃发酵条件下发酵时间控制在11 d，每隔1 d取样1次，将样品打碎，检测各项理化指标。

1.3.2 乳酸菌计数

依照国标GB/T 4789.35—2016[19]检测乳酸菌数量。

1.3.3 可滴定酸检测

依照国标GB/T 12456—2008[20]，样品总酸含量≤4 g/kg，以乳酸作为换算系数，计算可滴定酸含量。

1.3.4 氨基酸态氮检测

取5 g样品用50 mL 80 ℃蒸馏水洗涤，冷却后定容到100 mL，取20 mL滤液加入40 mL水，然后用NaOH溶液(c(NaOH)=0.1 mol/L)滴定至pH 8.2，再加入甲醛溶液10 mL充分混合后滴定至pH 9.2，通过NaOH溶液用量来计算氨基酸氮含量。

1.3.5 还原糖测定

依照国标GB 5009.7—2016[21]中第一法直接滴定法执行操作。

1.3.6 风味物质分析(GC-MS)

GC条件：载气为He；恒流；流速1 mL/min，初始温度60 ℃，保留时间3 min，以5 ℃/min上升至100 ℃ 后，再以10 ℃/min上升至280 ℃，保留10 min。

MS条件：电子电离源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，接口温度280 ℃，扫描 20～800 u。

1.3.7 微生物多样性检测

将微生物DNA从样品中抽提出来，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提出的DNA，采用通用引物338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，806R：5′- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′扩增DNA中V3、V4区域，然后，将所得扩增产物通过Miseq建库并检测，将所得结果采用OTU聚类整合分析。

1.4 数据统计方法

检测结果利用GraphPad Prism 5进行统计分析；GC-MS得到离子色谱图，通过计算机谱库检索，去除相似度低于80%组分，确定辣白菜风味化学成分。

2 结果与分析

2.1 接种发酵对乳酸菌数量的影响

发酵过程中除原料本身外，微生物的代谢对于辣白菜的风味有很大影响，而辣白菜发酵过程中的微生物以乳酸菌为主。从图1中可以看出，接种发酵组在发酵第5天微生物数量达到最高7.34 lg CFU/g，而后基本保持不变，相比之下自然发酵组在第7天乳酸菌数量才达到最高值，且到达稳定期后乳酸菌总数也略低于接种发酵组。

图1 发酵过程中乳酸菌数量的变化Fig.1 Viability of lactic bacteria during spicy cabbage fermentation

2.2 植物乳杆菌对pH和可滴定酸的影响

有机酸是辣白菜中重要风味物质之一，pH也是用来衡量产品是否发酵成熟的一个标志。一般认为pH值在4.2～5.0时为最适宜储藏时期和最佳的食用时期。从图2可知，自然发酵组pH值和可滴定酸含量变化较为平缓。

A-pH值变化；B-可滴定酸含量变化图2 发酵过程中pH值和可滴定酸的变化Fig.2 Change in pH and titratable acidity during spicy cabbage fermentation

随发酵时间的延长，总酸含量不断增加，pH值不断下降；而接种发酵在3～5 d，pH和可滴定酸含量出现较大变化，pH迅速降低，酸度迅速增加，其他时间变化趋势平缓，这与乳酸菌总数变化的结果相一致，说明植物乳杆菌的加入能促进辣白菜总酸量的增加，并加快成熟速度，缩短发酵时间。

2.3 植物乳杆菌对发酵过程中还原糖的影响

还原糖是乳酸菌的主要碳源和能量源，糖代谢也是许多风味物质的形成途径。由图3可以看出，在发酵前3 d，还原糖含量升高，可能是由于这段时间内能分解非还原糖的微生物作用，使样品中蔗糖等多糖类化合物分解为还原糖，而随着乳酸菌数量的增加，对于还原糖的利用也随之增加，直至乳酸菌和其他微生物数量达到相对稳定，还原糖含量也相对稳定。相比于自然发酵，接种发酵样品还原糖含量相对较高，可能是由于在植物乳杆菌的影响下促进了体系中非还原糖向还原糖的转化。

图3 发酵过程中还原糖含量的变化Fig.3 Change in reducing sugars during spicy cabbage fermentation

2.4 植物乳杆菌对氨基酸的影响

通过氨基酸态氮可以反映出产品中氨基酸的含量，氨基酸也是样品中的代谢产物，由图4可知，两组样品氨基酸含量都随着发酵的进行而增加，这与JEONG等[22]对于辣白菜中的氨基酸研究结果相近。

图4 发酵过程中氨基酸含量的变化Fig.4 Changes in amino acid content during spicy cabbage fermentation

王晓飞[23]研究发现，植物乳杆菌能在泡菜发酵时通过分解蛋白质产生丙氨酸，精氨酸，异亮氨酸等促进氨基酸含量增加，而从图4结果也可以看出，接种发酵组在发酵过程中氨基酸含量始终高于自然发酵组，最大氨基酸含量差异出现在第7天，接种发酵组氨基酸质量分数达到0.079 5%之后涨势趋于平缓，而自然发酵组氨基酸质量分数在第9天达到0.078%，之后增长率降低。

2.5 植物乳杆菌对发酵过程中挥发性风味成分的影响

从上述结果中可见，在整个发酵过程中乳酸菌数量和非挥发性风味物质在第1～7天变化较为明显，所以选取这段时间内的第1天，第4天和第7天3个时间节点检测辣白菜的挥发性风味成分。从表1结果可以看出，两组辣白菜样品中共检测出挥发性风味成分84种，其中包括硫化物4种、烯烃16种、醇类9种、醛类18种、酮类2种、酸类7种、酯类25种、芳香族化合物3种。其中硫化物在发酵的前期基本相似，发酵过程中，接种发酵样品中二甲基二硫化物和二甲基三硫化物含量都有所增加，而自然发酵组中，只有二甲基二硫化物化物在发酵到第4天时含量增加，其他各硫化物含量都与发酵第1天相近；烯烃是2组样品中含量较高也较丰富的一类成分，2组样品共有的成分有12种，在不同发酵时间含量相近，剩余的4种差异性成分含量均相对较低；除十二烯醇在发酵第1天短暂出现外，其他几种醇类成分几乎在2组样品中均有出现，在发酵的第4天，2组样品醇类成分种类完全一致，但发酵到第7天，自然发酵组中1-己醇和4-萜烯醇两种物质未能测出；醛类成分也是2组样品中种类较丰富的物质之一，2组中共有的醛类物质有11种，但从含量上来看，接种发酵第1天醛类总质量分数在7.9%，第4天和第7天时质量分数分别只有3.62%和4.29%，明显降低，而自然发酵组中，1～4 d同样表现出降低的趋势，但第7天检查出的含2-壬烯醛(黄瓜味、清香味)质量分数高达到12.54%；酮类成分种类相似，自然发酵组含量略高于接种发酵组；相比之下，酸类挥发性成分含量并不高，2组中共有的酸类成分有4种，其余2种均出自于接种发酵中，说明植物乳杆菌的接种对挥发性酸类物质的丰富有明显作用；酯类是挥发性成分中种类最丰富、含量最高的成分，也是2组间种类差异最大的风味物质，其中异硫氰酸苯乙酯和3-丁烯基异硫氰酸酯含量是样品中含量较高的两种成分，其中差异成分有8种，接种发酵样品中有部分酯类成分仅在第1天或第4天测出，导致第7天时酯类物质种类下降；对于芳香族化合物两组间差异不大，只有2,4-二叔丁基酚化合物仅在自然发酵的第1天和第4天存在。结合上述结果，说明植物乳杆菌的接种造成发酵过程中的风味物质成分明显变化，通过感官评价对比，发现两组样品最高感官得分相近，说明变化后的风味成分并未对感官造成负面影响。

表1 辣白菜发酵过程中主要挥发性风味成分及相对含量变化Table 1 Changes of main volatile flavor components and relative contents during spicy cabbage fermentation

续表1

类别物质名称气味描述相对含量/%J-1J-4J-7Z-1Z-4Z-7酸类辛酸汗水,奶酪0.21十二烷酸金属0.13十四烷酸0.120.130.130.110.150.16正十六烷酸0.851.281.330.831.822.03(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸0.110.330.090.2油酸脂肪0.160.15酯类辛酸乙酯水果,脂肪0.130.170.110.21水杨酸甲酯薄荷味0.06异丙酸三异丙酯0.17癸基-3-甲基丁-3-烯基富马酸酯0.490.653-丁烯基异硫氰酸酯10.559.5211.058.348.728.99二氢猕猴桃内脂0.210.180.160.250.240.2212-甲基三癸酸甲酯0.26十四烷酸甲酯鸢尾草味0.34十四烷酸乙酯醚味0.180.120.170.220.220.261,4-甲基-十五烷酸甲酯0.470.350.55十六烷酸甲酯蜡味0.380.470.46(Z)-9-十六碳烯酸甲酯0.05十六碳-9-烯酸酯甲基0.069-十六烯酸乙酯0.230.289,12-十八碳二烯酸甲酯0.088-十八碳烯酸甲酯0.120.18,11-十八碳二烯酸甲酯0.470.380.579-十八碳烯酸甲酯0.10.120.120.159-十八碳烯酸乙酯0.079,12-十八碳二烯酸甲酯0.330.450.450.099,12,15-十八碳三烯酸乙酯0.080.070.140.10.130.12油酸乙酯0.140.060.220.180.26亚油酸乙酯0.650.260.560.810.771.04苄基异硫氰酸酯辛辣0.40.560.350.48异硫氰酸苯乙酯7.714.54.527.915.467.76其他2-甲氧基-4-乙烯基苯酚杏仁0.240.120.152,4-二叔丁基酚0.180.1苯代丙腈0.770.570.670.730.630.67

注： J代表接种发酵，Z代表自然发酵。下同。

通过比较各成分相对含量，2种辣白菜的主要挥发性成分相似，主要包括二甲基二硫化物(洋葱味，白菜味)、二甲基三硫化物(白菜味，鱼味)、茴香烯、黄姜烯(青草味)、姜烯(香料味，清新味)、红没药烯(香油味)、芳樟醇(花香，薰衣草味)、2-甲基-3-苯基-丙醛、(E，E)-2,4-癸二烯醛(海草味)、3-丁烯基异硫氰酸酯和异硫氰酸苯乙酯。由于发酵的原料和发酵工艺的差异，发酵泡菜的挥发性风味成分也各有不同，主要成分也有差异，但其中二甲基二硫化物、二甲基三硫化物以及异硫氰酸苯乙酯广泛存在于各种辣白菜中[23-27]，这与本研究的结果相近。二甲基二硫化物和二甲基三硫化物阈值较低，是辣白菜中重要的风味物质[23-25]，通过对比接种发酵和自然发酵样品，二甲基二硫化物和二甲基三硫化物的含量明显增加，说明该植物乳杆菌对辣白菜的挥发性成分有明显的改善作用。

2.6 植物乳杆菌对菌群结构的影响

如图5所示，当发酵到第7天接种发酵样品中乳杆菌占相对含量的98.16%，明串珠菌占1.08%，魏斯氏菌占0.03%，自然发酵组中乳杆菌占相对含量的21.98%，明串珠菌占65.02%。魏斯氏菌占1.1%，从这个结果上可以看出，接种发酵后乳杆菌属在样品中占领绝对优势，也导致其他细菌的含量降低，相比于自然发酵微生物丰富度较低。

图5 发酵第7天辣白菜中细菌物种分布Fig.5 Genus-level distribution of bacterial from spicy cabbage samples at the 7th day of fermentation

3 结论

本研究通过对比自然发酵和以植物杆菌作为发酵剂的接种发酵辣白菜发酵过程中非挥发性风味物质和挥发性风味物质发现，植物乳杆菌接种能使辣白菜发酵过程中乳酸菌总数增加，从而促进非挥发性酸类物质的产生，加快辣白菜的成熟，缩短发酵周期，酸类物质主要由乳酸菌的糖代谢产生，但接种后发酵的辣白菜样品中还原糖含量却高于自然发酵组，这可能是由于植物乳杆菌在增加还原糖代谢的同时也促进了其他非还原糖向还原糖的转化，同时，接种发酵也可以促进氨基酸的产生，提高氨基酸总量；从挥发性风味物质的检测结果表明，无论自然发酵还是接种发酵的过程中挥发性成分都是不断变化的，植物乳杆菌的接种也造成了挥发性风味成分的变化，最突出的变化表现在醇类和酸类成分种类的增加以及其中酯类化合物种类的变化。微生物结果表明，植物乳杆菌接种会增加发酵体系中乳杆菌属的含量，乳杆菌属大多属于同型发酵乳酸菌，产酸量较高，这与非挥发性风味物质中酸量增加结果一致，从风味上看也造成部分香气成分的损失，但二甲基二硫化物和二甲基三硫化物含量明显增加。

综上所述，植物乳杆菌的加入，能加快辣白菜的发酵，缩短发酵时间，增加非挥发性酸的含量和挥发性酸的种类。虽然其他微生物在发酵结束时含量较低，但它们对辣白菜风味产生的影响同样不容忽视，在复杂的发酵体系中，植物乳杆菌与这些微生物之间的相互作用仍有待于进一步研究。