QuEChERS萃取-液相色谱法测定酱油和酱制品中三氯蔗糖

宋佳,李锦清,李聪,周勇,黄翠莉,綦艳

(广东产品质量监督检验研究院,国家食品质量监督检验中心(广东),广东 佛山，528300)

三氯蔗糖极易溶于水，具有甜味纯正，化学稳定性好，高温下甜味不变，甜度稳定，无毒副作用等优点[1-2]，广泛应用于酱油、饮料、乳制品、饮料酒[3-4]和果酱等加工食品中，在国内外允许使用的各种甜味剂中，三氯蔗糖是特征性优点最多的一种。我国GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》对酱油和酱制品中三氯蔗糖的允许添加量进行了规定，规定其最大使用量不得超过0.25 g/kg[5]。

目前食品中三氯蔗糖检测标准有国家强制性标准GB 22255—2014[6]和地方标准DBS52/ 007—2014[7]。GB 22255—2014标准规定含有蛋白脂肪样品、酱及及酱制品、醋、酱油、饮料等样品采用填料为N-乙烯基吡咯烷酮和二乙烯基苯亲水亲脂平衡型填料的固相萃取柱进行净化、富集，含酒精的试样采用蒸干后用乙腈水溶液溶解的前处理方法。DBS52/ 007—2014标准规定白酒样品采用水稀释后直接检测的前处理方法。另外，国内文献报道的食品中三氯蔗糖提取方法有甲醇、乙醇或乙腈萃取法[8-10]、固相萃取法[11-12]、直接稀释法[13-14]、沉淀蛋白后直接测定法[15-18]等，其中以固相萃取法为主，使用的固相萃取柱有HLB柱[19]、中性氧化铝柱[20]、C18固相萃取柱[21]等。由于酱油、酱制品等含有大量色素，上述的前处理方法去除色素效果并不明显，其中HLB柱、C18柱、中性氧化铝柱萃取时三氯蔗糖和大部分色素均被保留在固相萃取柱上，并随洗脱液一起洗脱，未能达到去除色素，净化样品的目的。直接稀释法、甲醇或乙腈萃取法、沉淀蛋白后直接测定法去除效果更差，仅适用于色素含量低或不含色素的样品。大量存在的色素在检测过程中容易损坏色谱柱，污染检测器，甚至可能影响定性和定量，因此有必要建立一种回收率高、净化效果好的前处理方法。

QuEChERS法是一种广泛用于农产品检测的快速前处理技术，对样品中的色素去除效果明显。目前，尚未有应用QuEChERS法作为酱油、酱制品中三氯蔗糖的前处理方法的研究报道，本研究将QuEChERS方法进行了改进，用于萃取酱油和酱制品中三氯蔗糖，建立的前处理方法具有简单、快速、回收率高、净化效果好、成本低等优点，适用于大批量样品的快速检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三氯蔗糖标准品(纯度99.0%)，德国Dr.EhrenstorferGmbH公司；乙腈(分析纯)，天津市永大化学试剂有限公司；乙腈(色谱纯)，美国TEDIA(天地)公司；NaCl、无水MgSO4(分析纯)，广州化学试剂厂。

1.2 标准溶液配制

精密称取三氯蔗糖标准品约15 mg(精确至0.1 mg)， 置于10 mL容量瓶中，加入超纯水，轻轻摇匀，再用超纯水定容至10 mL，摇匀，配得标准物质储备溶液为1 500 μg/mL。取适量体积三氯蔗糖标准储备溶液，用超纯水逐级稀释配制标准工作曲线，配制质量浓度为20～1 500 μg/mL。

1.3 仪器与设备

LC-20A岛津高效液相色谱仪(配置ELSD-LT Ⅱ蒸发光散射检测器)，日本岛津公司；Sigma 3-18K高速冷冻离心机，美国Sigma公司；IKA涡旋混合器，德国IKA公司；EYELA旋转蒸发仪，日本东京理化公司；Milli-Q去离子水发生器，美国Millipore公司；DT-502A电子天平，常熟市金羊砝码仪器有限公司。

1.4 液相色谱条件

流动相为：V(乙腈)∶V(水)=14∶86，等度洗脱方式；色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)； 流速：1.0 mL/min；柱温：室温；进样量：20 μL； 蒸发光检测器溶剂蒸发温度为40～60 ℃，雾化气体为氮气，氮气气体压力为350～420 kPa。在本方法条件下，三氯蔗糖保留时间为12.15 min。

1.5 前处理步骤

称取均匀酱油或酱制品5 g(精确至0.01 g)置于50 mL塑料离心管中，加入5 mL超纯水，摇匀，加入20 mL乙腈，涡旋1 min，依次加入NaCl 5 g、无水MgSO42 g，立即剧烈涡旋1 min，使样品变稠状，9 000 r/min 离心2 min，将上层清液(乙腈层)转移至125 mL 鸡心瓶中。离心管中的样品再用20 mL乙腈重复萃取1次，涡旋1 min，9 000 r/min离心2 min，乙腈层合并于鸡心瓶中，50 ℃水浴旋转蒸发至干，用1.0 mL 超纯水溶解，涡旋30 s，加入1.0 mL正己烷脱脂，涡旋，静止分层，取下层水相过0.45 μm水系膜置于进样瓶中，用液相色谱-蒸发光散射检测器检测。

2 结果与分析

2.1 前处理条件的选择

目前文献报道的前处理方法有甲醇或乙腈萃取法[22]、固相萃取法、直接稀释法、沉淀蛋白后直接测定法等，其中以固相萃取法为主[23-24]。由于酱油或酱制品含有较多油脂和大量的色素，上述的这些前处理方法对色素等杂质的去除效果较差，其中甲醇或乙腈萃取法、直接稀释法、沉淀蛋白后直接测定法均不能去除酱油样品中的黑色素。固相萃取法有HLB固相萃取柱、C18固相萃取柱、中性氧化铝柱净化法，这些固相萃取柱能将大部分色素和目标物同时保留，同时被洗脱液洗脱，未能达到去除色素的目的，大量共存的色素在检测过程中容易损坏色谱柱，污染检测器，甚至可能影响定性和定量。

QuEChERS法是水果蔬菜等农产品检测的快速前处理技术，对蔬菜中的色素净化效果明显。QuEChERS法包括萃取过程和净化过程，萃取过程使用的试剂一般为乙腈、乙酸钠、无水MgSO4等，目的是去除色素等杂质初步净化样品。净化过程使用PSA粉(乙二胺-N-丙基硅烷)、C18粉末或两者混合，目的是进一步净化样品，适用于对样品净化要求较高的质谱检测。PSA粉、C18粉末价格较贵，大批量样品检测时使用量较大，检测成本高。

本研究将QuEChERS方法进行了改进，以乙腈作为萃取溶剂，NaCl和无水MgSO4作为辅助萃取剂，不经过PSA粉或C18粉末的净化步骤，大大降低检测成本，同时也获得较好的回收率和净化效果。

试验比较了不加NaCl和无水MgSO4的情况下，样品直接用乙腈萃取，结果表明回收率仅有50%左右，原因是部分三氯蔗糖未被乙腈萃取，保留在水中。当仅加入NaCl时，由于乙腈层含有少量水，在旋转蒸发时容易暴沸，导致含量损失。样品中加入NaCl和无水MgSO4，样品中加入的NaCl，起到盐析和降低乙腈和三氯蔗糖在水中的溶解度的作用。无水MgSO4去除乙腈中水分，与NaCl盐析作用相配合，使乙腈对三氯蔗糖的萃取回收率达到80%以上。则可去除乙腈中的水分，避免暴沸的同时提高了回收率和净化效果。对比使用C18固相萃取柱法、HLB固相萃取柱法、中性氧化铝柱法提取三氯蔗糖的效果。刘芳等[21]使用C18固相萃取柱法提取不同状态食品中的三氯蔗糖，样品平均回收率为85.6%～108.2%；在HLB固相萃取柱法方面，赵贞等[19]在乳制品中所得回收率为94.6%～101.3%。此外，张伟清等[25]使用中性氧化铝柱在酱油及酱制品测定三氯蔗糖回收率为85.2%～108.8%。由于酱油或酱制品含有大量的色素与杂质，张伟清等[25]研究发现以3 000 r/min处理后所得试液仍难以通过中性氧化铝柱，故使用固相萃取柱对样品处理要求高，且除色素效果不佳。而QuEChERS在去除色素效果显著，操作简单，回收率也可达83.2%～95.4%，与固相萃取法相当。

2.2 线性范围和检出限

在优化的检测条件下，采用不含三氯蔗糖的酱油和酱制品样品添加标准物质方式考察本方法的检出限。结果表明，酱油和酱制品样品中三氯蔗糖的方法检出限(LOD)为1 mg/kg，定量限(LOQ)为3 mg/kg，低于GB 22255—2014标准的检出限(2.5 mg/kg)和定量限(7.5 mg/kg)。本方法三氯蔗糖的指数拟合线性范围为20～1 500 μg/mL，指数拟合线性方程为Y=0.745X×e-3.826，相关系数为r2=0.998。

2.3 加标回收率及精密度

采用不含三氯蔗糖的酱油和酱制品样品添加标准物质的方式考察方法的回收率和精密度。分别添加3个水平标准物质，添加水平为4、100、250 mg/kg(MRL)，每个水平平行测定6次。三氯蔗糖的平均回收率为83.2%～95.4%，精密度(RSD)为4.1%～6.3%，结果表明，建立的前处理方法具有较好的回收率和精密度。回收率和精密度数据见表1。

表1 不同样品中三氯蔗糖的加标回收率与相对标准偏差(n=6)Table 1 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of sucralose in different samples

图1为空白酱油样品(不含三氯蔗糖的样品)的色谱图，图2为空白酱油样品添加标准品(100 mg/kg)的色谱图。比较图1和图2可知，在三氯蔗糖出峰时间附近无干扰峰，说明建立的前处理方法净化效果良好，有效去除杂质干扰。

图1 空白酱油样品色谱图Fig.1 Chromatogram of blank sample

图2 空白酱油样品添加标准品(100 mg/kg)色谱图Fig.2 Chromatogram of spiked blank sample

2.4 实际样品检测

从市场上购买40份酱油和35份酱制品，按照本方法进行检测，酱油中检出添加三氯蔗糖的样品9份，占酱油抽样总数的22.50%；酱制品中检出添加三氯蔗糖的样品3份，占酱制品抽样总数的8.57%。在抽检的酱油和酱制品中，标签标识含有三氯蔗糖的样本均有检出，未标识含有三氯蔗糖的样本均低于方法检出限，检测添加三氯蔗糖的样品均符合GB 2760—2014最大用量为0.25 g/kg的限量要求。

验证本研究建立的前处理方法的可靠性，采用GB 22255—2014标准对上述含有三氯蔗糖的酱油或酱制品进行检测，结果表明，2种方法的三氯蔗糖检测结果的相对标准偏差不超过10%。相同样品含量及加标回收率见表2。

表2 相同样品中三氯蔗糖的含量与加标回收率Table 2 The content and recovery of sucralose in the same sample

注：预处理1方法为GB 22255—2014法；预处理2方法为QuEChERS法。

本研究建立的前处理方法与国标前处理法相比，对经济成本上而言，由于QuEChERS前处理方法未使用Hlb柱，节约了实验成本；从效率上考虑，QuEChERS前处理方法操作更加简单快速，效率更高，有益于大规模分析检测。同时，国标法所得待测液，颜色深，受色素影响较大，样品基质效应影响较强。

3 结论

方法学验证和实际样品检测的结果表明本研究针对酱油及酱制品的特点，建立的改进型QuEChERS前处理方法，具有简单、快速、回收率高、净化效果好、成本低等优点，适用于大批量样品的快速检测，可作为企业在生产过程中的质量监控方法。