不同竹子内生细菌结构和多样性比较研究

高 竞，冯歌林，严淑娴 ，秦 华，陈俊辉，梁辰飞，徐秋芳

（1.省部共建亚热带森林培育国家重点实验室，浙江农林大学，浙江杭州311300；2.浙江农林大学环境与资源学院，浙江杭州311300）

植物内生菌（Endophyte）普遍存在于木本、草本植物，单子叶植物和双子叶植物中，一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部［1］。目前在植物中发现的内生细菌已有54个属、129种，其中常见的属包括假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（BacillusCohn）、肠杆菌属（Enterobacter）以及固氮螺菌属（Azosprillum）［2］。植物内生细菌对宿主植物的作用主要表现为以下几个方面，促进生长、增加宿主植物抗虫害潜力、增加宿主植物对环境胁迫的抗性、增加他感作用、抗病原菌作用等有益效应［3］。同时，植物内生细菌还是重要的生物资源，柳凤等［4］从红树中筛选出可分泌较稳定的非蛋白类抗菌活性物质的细菌菌株，能对芒果炭疽病菌产生抑制作用。

影响植物内生菌主要有植物本身和环境两方面。如植株种类、植株生活史、种植地区、植株不同组织对内生细菌多样性的影响。橡胶树不同组织内生细菌数量和种类由多到少依次为，树根、花序、树皮、叶柄、叶片和果实［5］。孙占斌等［6］研究黄瓜初花和结瓜2个生长期叶片发现，可培养内生细菌初花期内生菌的丰度是结瓜期的5倍，并且2个时期内生菌的种类表现出很强的差异。孙岩［7］通过对3种受不同程度溃疡病影响的杨属植物的内生细菌进行研究，健康植株样品中的细菌生物量普遍少于非健康样品，而细菌物种多样性与植物的抗性成正比。然而，植物内生菌也存在共性，车健美等［8］通过对不同禾本科牧草植株内生细菌进行可培养研究发现，内生细菌具有较丰富的遗传多样性以及功能多样性，不同品种之间存在共有菌群。植物内生菌对环境和季节的反应存在差异，同一品种烟草种植在不同地区，其内生细菌数量不尽相同［9］，说明环境对植物内生菌有重要影响；蕙兰根部内生细菌数量随季节而变化，秋季分离出的内生细菌种类最多、夏季最少，两者差异极显著［10］。

竹子（Bambusoideae）属于禾本科植物，物种多样性丰富，全球有70属1 200多种，是集经济、生态和社会效益于一体的森林资源，在现代林业和区域经济中具有重要地位［11］。揭示竹子内生细菌的结构特征和物种多样性，对竹子的生产培育具有一定的实用意义。研究者对竹子内生细菌的研究发现，不同地区的毛竹（Phyllostachys edulis）竹鞭内生细菌组成存在较大差异［12］；而对毛竹根际细菌、根面细菌和根部内生细菌的研究发现，毛竹根际可培养细菌种群数量最高，其次为根面细菌和根部内生细菌，并且有较多共有菌种［13］；固氮细菌可以通过植物自然开口与伤口进入植物体内［14］。侯伟［15］从广东省刺竹（Bamboosa blumeana）中分离到40株高效固氮酶活性菌株，它们分别属固氮螺菌属（Azosprillum）、埃希氏杆菌属（Escherichchias）、假单胞菌属（Pseudomonas）和水螺菌属（Aquaspirillum）；而这些菌种都能在土壤中找到相似菌株。以上研究初步揭示了竹子内生细菌多样性特征及其与环境的关系，但竹子种类多、分布广，仅仅以一种竹子为对象进行研究，不能很好地认识竹子内生细菌的真实情况。

研究以生长于同一区域的散生毛竹（Phyllostachysedulis）、丛生孝顺竹（Bambusa multiplex）和混生窄叶苦竹（Pleioblastus amarus）等3种代表性竹子为研究对象，应用分子生物技术，分析不同竹子、不同组织内生细菌以及其定植的根际土壤细菌，揭示3种竹子内生细菌的特征和多样性及其与环境微生物的关系。

1 材料与方法

1.1 样品采集

分别在浙江农林大学竹种园的孝顺竹、窄叶苦竹及毛竹林地采样，每种竹子样品选取3株不同植株（相当于3个重复），各植株之间适当间隔；选取生长力旺盛的健康植株采取根与叶，采集每个竹子对应的根区土壤（深度0～30 cm），带回实验室冰箱中保存。一部分土壤样品经风干、磨细、过筛后，用于土壤化学性质的测定；另一部分样品处理后保存于-80℃冰箱内，用于DNA提取。

1.2 分析方法

1.2.1 土壤理化性质测定 参照《土壤农化分析方法》［16］，分析土壤pH、有机质、碱解氮、有效磷、速效钾等5个常规指标，土壤pH利用pH计法测定，土壤有机质采用重铬酸钾外加热法测含量，土壤有效氮采用碱扩散法，土壤速效磷含量采用钼锑抗比色法测定，土壤速效钾含量采用火焰光度计法测定。

1.2.2 土壤细菌DNA提取 采用美国Mobio公司的土壤微生物DNA试剂盒（PowerSoil Kit）提取土壤细菌DNA。严格根据说明书上步骤进行操作，提取的每份DNA分装3管保存。取4μL DNA采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA是否提取成功。

1.2.3 植物组织细菌DNA提取 植物样品灭菌预处理。在超净台内对植物叶、根进行表面灭菌预处理过程如下：用超纯水洗净叶、根表面的杂质，依次用5%双氧水和5%次氯酸钠对叶与根表面分别进行洗消毒10 min，每次消毒结束后用无菌水清洗2-3次。

植物组织细菌DNA提取。参考高志民等［17］改良后的CTAB法，用液氮充分研磨碎植物样品后取等量加入到离心管中，加入约600μL CTAB溶液，65℃水浴1 h，期间每5 min上下晃动离心管。取出冷却至室温后加入700～800μL的氯仿-异戊醇混合液（V/V=24/1），离心后将上清液移至1.5 mL新管中，加入等体积冰异丙醇充分摇晃，离心后倒掉异丙醇、留下底部DNA白色沉淀，然后用无水乙醇洗涤DNA，倒掉乙醇后自然晾干。最后加入40μL无菌水溶解DNA，于-40℃冰箱内保存。

1.2.4 土壤细菌和植物内生细菌的PCR扩增 土壤细菌和植物内生细菌均选用细菌通用引物968 f和1 401 r［18］，扩增16SrDNA基因V6～V8高变区。引物968 f-带GC夹序列为CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCC GGCCCGCCGCCCCCGCCCCAACGCGAAGAACCTTAC。引物1 401 r序列为CGGTGTGTACAAGACCC（由上海生工生物技术有限公司合成）。扩增体系组成为：Premix 20μL，引物968 f（10 mM）1μL，引物1 401 r（10 mM）1μL，BSA 1μL，DNA 2μL，无菌水15μL。扩增条件：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸3 min，30个循环，结束后再72℃延伸8 min。取4μL PCR产物经1.5%（m/v）琼脂糖凝胶电泳检测，然后用Goldview染色，确认其片段大小，保存在-20℃冰箱内。

1.2.3 DGGE技术 参照Maria［19］方法，使用DcodeTM基因突变检测系统（BIO-RAD，USA）进行变形梯度凝胶，对PCR产物进行电泳分离分析。聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，变性梯度为45%～60%［20］。在1×TAE缓冲液中温度电压60℃、80 V条件下13 h。电泳结束后用EB染液染色10 min，使用紫外凝胶成像系统拍照。

1.2.4 QUANTITY ONE软件分析 Quantity one软件对土壤及根叶样品DGGE电泳图进行指纹图谱分析，对植物根、叶样品进行聚类分析。

以DGGE条带信息为依据，应用SPSS软件对土壤及根、叶样品数据进行香农多样性指数多重比较分析。

2 结果

2.1 土壤理化性质分析

3种竹子所定植土壤的pH、有机质、碱解氮、有效磷、速效钾等5个指标如表1，各项指标的平均值有高低之分，但所有指标、所有土壤之间均没有显著性差异，3块地区养分没有显著性差异，说明可以忽略土壤性质对竹子生长的差异影响。

表1 3种竹种地土壤理化性质Tab.1 Physical and chemical characteristics of soil collected from three types of bamboo stands

2.2 土壤细菌和竹子根叶内生细菌PCR扩增结果

对植物和土壤 DNA分别进行 PCR扩增（图1），在500 bp左右出现了明亮的条带，确定为细菌16SrDNAV6～V8片段。

图1 竹子内生细菌（A）和土壤细菌（B）和PCR扩增效果图Fig.1 The gel electrophoresis of PCR products for entophytic bacteria of bamboo（A）and for soil bacteria（B）注：文中 XT，XY，XG，MT，MY，MG和 ZT，ZY，ZG分别代表孝顺竹、毛竹和窄叶苦竹土壤、叶、根，1、2和3分别代表重复Note：The XT，XY，XG，MT，MY，MG and ZT，ZY，ZG in the article present partly Bambusa multiplex，Pleioblastus amarus，and Phyllostachys pubescens′s soil，leaves，roots，and the number of 1，2，3 present three repeats.

2.3 土壤细菌群落结构分析

DGGE图谱中条带的多少直接反映样品中微生物的多样性，条带数量越多标志样品中所含细菌种类越多，条带越粗说明该种菌的生物量越大［20］。比较孝顺竹、毛竹、窄叶苦竹生长对应土壤细菌条带发现，同一竹种定植3个土壤重复相似度最高（图2A），而不同竹种土壤之间存在差异；然而，毛竹和窄叶苦竹之间有较高的相似度，且条带数量与亮度明显比孝顺竹高。分析发现9个样品共产生了28条不同的条带，共性条带占总条带数量的78.6%，说明3个竹种土壤中的细菌种类数接近，但不同竹种土壤细菌的丰度差异较大。

为了更准确地揭示不同土壤细菌群落的差异程度，以DGGE条带位置和密度的定量信息为依据对土壤细菌群落结构进行聚类分析。结果表明，所有土壤聚合的相似值为0.63（图2B），一般认为相似值高于0.60的2个群体具有较好的相似性，说明总体上3类竹子的根区土壤细菌的群落结构没有显著性差异。进一步分析不同竹种之间以及重复样品的相似性发现，孝顺竹的3个重复聚集在1个组，其他2种竹子3个重复没有完全聚在一组，相对而言，孝顺竹土壤细菌的结构与其他2种差异较大。

图2 土壤细菌基因片段扩增后DGGE指纹图谱（A）和聚类分析树（B）Fig.2 The DGGE fingerprint（A）and clustering analysis tree（B）of soil bacteria

2.4 植物内生细菌群落结构分析

3种竹子内生细菌的DGGE结果表明，叶子内生细菌的条带数量比根部相对多一些，但没有明显差异（图3）；孝顺竹和窄叶苦竹的同一组织的3个重复性较好，大部分为共性条带，而毛竹的重复之间相似性较差；18个植物样品共产生了23条不同的条带，其中孝顺竹、毛竹和窄叶苦竹的叶组织平均条带数分别为18、17和17，对应的根组织内生细菌的条带数分别为18、19和17。孝顺竹叶和根的条带数量多于其他竹种，亮度也比其他2种竹种高，说明孝顺竹内生菌丰度较其他2种更高。为了揭示植物内生细菌与土壤细菌关联程度，选择条带数最多的窄叶苦竹2号土壤样品作为参照，与植物样品同批进行DGGE。结果发现，土壤细菌的条带数明显比植物内生细菌多，除少数植物内生细菌条带外，大部分与土壤细菌相同，说明植物内生菌主要从土壤进入植物。

图3 竹子叶与根内生细菌DGGE指纹图谱Fig.3 The DGGE fingerprint of the endophytic bacteria in bamboo leaves and roots

为了更准确地揭示不同土壤细菌群落的差异程度，以DGGE（图3）条带位置和密度的定量信息为依据进行聚类分析发现，除了MG3和ZG3的其他根样品聚集在树状图最下方（图4），在相似值为0.53水平与其他样品分开，说明竹根的内生细菌与竹叶子及土壤存在较大差异；土壤样品没有单独与植物样品分开，反而与毛竹叶子相似值为0.57；条带结构差异最大的ZG3，在相似值为0.33水平与其他所有样品分开。综观不同样品之间的相似值发现，植物叶和根组织中，不是所有竹种的3个重复样品都完全聚在一组，虽然有些组织的2个重复（ZY3与ZY1）相似度比较高，但同一植物、同一组织的内生菌仍有结构差异。因此，聚类分析能更加准确反应样品之间的差异。

2.5 土壤样品与植物细菌多样性分析

以DGGE条带数量和密度为依据计算香农多样性指数（表2），相同组织不同竹种的比较结果表明，孝顺竹的叶和根内生细菌多样性均显著高于（P＜0.05）其他2种竹子的对应组织，而孝顺竹土壤的细菌多样性则明显低于（P＜0.05）其他2种土壤，说明植物内生细菌多样性受竹子种类影响；同一竹种的叶和根之间内生细菌多样性没有显著性差异，而土壤的细菌多样性显著高于（P＜0.05）叶和根。

图4 植物样品聚类分析树Fig.4 The clustering analysis tree of plant endophytic bacteria

表2 3种竹子叶、根、土壤细菌的香农多样性指数（Shannon diversity index）比较Tab.2 The bacterial Shannon diversity index of tissue leaf，roots and soil samples

3 讨论与结论

不同竹子根区土壤细菌的结构和多样性比较：从研究竹子定植土壤的理化性质分析中发现，5项主要理化性没有显著差异，然而，不同竹子定植土壤的细菌群落结构和多样性则存在差异。其中孝顺竹土壤的条数量和亮度均低于毛竹和窄叶苦竹（图2A），多样性指数显著低于（P＜0.05）毛竹和窄叶苦竹（表2）。3种土壤的理化性质基本一致，导致孝顺竹土壤细菌多样性明显低于其他2种竹子，可能是植物遗传差异所致。同一种植物在同一地点连续种植会产生“连作障碍”［21］，单一植物的根系分泌物是导致微生物多样性下降的重要原因之一。虽然3种竹子均属于连作范畴，但丛生的孝顺竹生长地点完全固定，而散生毛竹和混生窄叶苦竹单体的位置沿着竹鞭延展不断变化，竹根以及根系分泌物没有固定空间，它对根区土壤微生物的影响程度不如孝顺竹强。聚类分析显示3种竹子根区土壤细菌的群落结构差异也证明了以上推测（图3），表现为孝顺竹3个样品的重复性好且聚集在一组，而另一组的毛竹及窄叶苦竹重复性较差，2种竹子的样品交叉排列，6个样品在相似值0.65水平上相聚。

通过DGGE方法研究发现，土壤细菌多样性显著高于竹子组织内生菌符合大部分研究结果。如夏冬亮［13］研究发现，天然毛竹林与人工毛竹林中根际土壤细菌、根面细菌与根内细菌均具有共同菌种，而菌种多样性根际最高，根部内生菌最低。植物内生菌明显低于土壤的原因：细菌从土壤到根表、根内部的过程中要突破层层屏障，从根部再到地上的茎杆和叶子同样要突破层层屏障。因此，不同植物组织内生菌表现为根部数量最高、其次为茎和叶、种子最少［22-23］，这种梯度规律不受植物生长阶段以及植物生长影响［22］。根际土壤细菌数量和种类＞植物根部内生细菌＞叶子内生细菌可视为一般规律［22-24］。然而，研究发现竹子根和叶内生细菌种类多样性没有显著差异，有可能是竹子组织结构之间的通道比一般农作物大［25］，利于细菌的迁移。研究表明，细菌通过主动（微生物分泌分解细胞壁酶穿过中柱鞘到达木质部导管）和被动（组织内的自然通道被动渗透）的2种侵入方式进入植物根部以及在体内传输；内生菌通过主动方式侵入植物体内的能力和数量主要取决于细菌的特性，而被动形式则更多的受到组织内部通道大小的影响，竹子组织内部通道能通过细菌进行被动传输。但也有一些作物如湖光尖椒，会出现其叶片内生细菌多样性高于根部的情况［26］。以上结果说明内生细菌的数量以及在植物不同器官的分布规律主要受植物遗传特性影响，包括空间通道的物理特性以及对外界细菌侵染感应等生物特性，但确切的机理有待深入研究。土壤细菌条带数量显著大于竹子内生细菌，除少数几个条带外，竹根和叶大部分条带与土壤一致，说明植物内生菌主要来自土壤，少部分来自空气。其他研究也得到类似结果［27-28］。同一竹种、同一组织的重复样品之间具有较好的相似性，相似值最高达到0.87（ZY1和ZY3）；虽然竹子根和叶内生细菌种类多样性没有显著差异，但根部内生菌群落结构与叶子有较大差异（图4）。以上差异结果主要有两方面原因：一是土壤细菌的空间异质性，袁宗胜等［12］对毛竹竹鞭内生细菌的特征和多样性进行研究发现，来源于不同地区的毛竹竹鞭内生细菌组成存在较大差异。长期丛生于同一地点的孝顺竹，其根和叶内生细菌的重复性明显高于其他2种竹，这一结果证明土壤异质性对竹子内生细菌的不同影响；二是竹子遗传特性、生长时间以及长势差异。孝顺竹（丛生竹）的遗传特性与毛竹（散生竹）和窄叶苦竹（混生竹）差异较大。另外，虽然采样时选择比较一致的健康竹子，但竹子的生势仍然可能存在差异，采集的竹子样品还可能不是同一年生的（采样时没有专门区分竹龄）。植物遗传特性对内生细菌影响还表现在同一作物的不同品种。罗明等［29］研究发现抗病品种哈密瓜的内生细菌物种多样性高于感病品种，杨树属不同品种内生细菌也发现类似现象［12］。

土壤细菌是植物内生细菌的主要来源，理论上推测土壤细菌和植物内生细菌是正相关关系，土壤细菌越多则植物内生细菌越多。而研究中的孝顺竹却出现反相关现象，其土壤细菌多样性显著低于其他2种竹子，而植物根和叶子的内生细菌则正好相反。可能是孝顺竹的生理特性和组织结构与毛竹及苦竹不同所致。具体分析如下：一方面可能与其长期丛生于同一地点有关，有利于内生细菌的积累；另一方面可能是丛生竹的组织结构与散生或混生的不同，更加有利于细菌侵入植物根部以及在体内传输。当然，这些主要是推测，需要进一步的研究支撑。

结论，土壤细菌是竹子内生细菌的主要来源，竹子种类对土壤细菌结构和多样性有一定影响。孝顺竹定植土壤细菌多样性显著低于毛竹和窄叶苦竹，其群落结构与其他2种竹子差异相对较大。土壤细菌群落多样性显著高于竹子的内生细菌，竹叶和根部组织之间没有显著差异。相同组织孝顺竹内生细菌多样性明显高于（P＜0.05）毛竹及窄叶苦竹。以上结论可能存在局限性，因为DGGE技术只能检测到样品中数量大于1%的优势菌种［30］，以后将采集更多的来自不同土壤的竹子样品，用高通量测序技术结合传统培养方法进行深入研究，以揭示竹子内生细菌的特征和多样性及其与环境微生物的关系。