基于ISSR分子标记技术的杏鲍菇种质资源评价

杨和川，苏文英，谭一罗，秦裕营，马 腾，浦汉春，周振玲

(连云港市农业科学院，江苏 连云港 222006)

【研究意义】杏鲍菇(Pleurotuseryngii)又名刺芹侧耳，隶属于担子菌门(Basidiomycota)、伞菌亚门(Agaricomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、伞菌目(Agaricales)、侧耳科(Pleurotaceae)、侧耳属(Pleurotus)[1]。杏鲍菇营养丰富，其子实体的菌肉肥厚，口感极佳，兼具鲍鱼口感和杏仁香味，深受广大消费者的喜爱，是目前我国工厂化栽培的珍稀食用菌品种之一。但杏鲍菇子实体形态特征、生长周期及产量性状等受外界环境因素影响较大，同一株菌株在不同栽培环境中子实体形态特征会产生较大的差异，且因为缺乏严格的菌种管理制度，使得“同种异名”现象广泛存在，使杏鲍菇的遗传育种研究工作难以开展，因此目前工厂化栽培的杏鲍菇品种十分单一，且生物转化率比较低。【前人研究进展】ISSR(简单序列重复区间扩增)标记技术是1994年由Zietkiewicz[2]等建立的一种分子标记技术，该技术是基于SSR(简单重复序列)基础上发展起来的。ISSR分子标记具有操作简单、可重复性高、稳定性好及变异位点丰富的特点，在食用菌品种鉴定及遗传多样性分析中得到广泛的应用[3-6]。荧光毛细管电泳技术由于其自动化及分析精细的特点，被广泛应用在作物的遗传关系分析中[7-9]，与传统的PAGE银染法相比，其准确性和灵敏度具有更高的优势[10]。【本研究切入点】因此，本研究借助该项技术，通过体细胞不亲和性、分子标记技术及农艺性状的比较分析，详细、系统的对杏鲍菇菌株进行种质资源的综合评价。【拟解决的关键问题】筛选出具有开发潜力的优良菌株作为育种的试验材料，为杏鲍菇育种手段和方法的深入研究和开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 供试菌株见表1，其中LX4为工厂化栽培品种。

1.1.2 培养基配方 PDA培养基(固体)：用于供试菌株的培养。将马铃薯去皮后称取200 g，切成正方形小方块，于电磁炉煮沸，过滤后加入20 g葡萄糖，10 g琼脂粉，定容至1 L，pH自然，于121 ℃高压灭菌。

MYG液体培养基：麦芽糖5 g，葡萄糖5 g，酵母浸粉10 g，琼脂粉15 g，pH值自然，加水定容至1 L，121℃高压灭菌30 min。

栽培种培养基：玉米芯25 %、木屑35 %、麦麸24 %、玉米粉10 %、豆粕4.5 %、石灰0.5 %、轻质碳酸钙1 %。

1.1.3 试剂 10 × PCR Buffer(含 Mg2+)，dNTP，TaqDNA 聚合酶等试剂均由赛默飞世尔科技(中国)有限公司提供。

1.2 体细胞不亲和性实验

将27株供试菌株于25 ℃恒温培养7 d复壮后，用8 mm打孔器打孔随机选取3个不同菌株的菌块接种于同一MYG平板上，于25 ℃恒温箱中培养10 d，此为1个处理，每个处理接种3个平板为3 次重复，观察不同菌株菌落接触部分的拮抗反应，将拮抗结果的有(+)、无(-)进行统计。

1.3 ITS分析

以ITS1和ITS4(表2)为引物对27个供试菌株进行 PCR 分析。反应总体系为50 μl: 10×PCR buffer(含 Mg2+) 10 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，TaqDNA 酶1 μl，F Primer 2 μl，R Primer 2 μl，模板 DNA 3 μl，ddH2O 31 μl；PCR 扩增程序：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，30 个循环，72 ℃延伸2 min。PCR扩增产物送金唯智(南京)测序。测序结果通过NCBI进行同源序列比较。

1.4 ISSR分析方法

本实验所用引物选自哥伦比亚大学UBC公布的ISSR引物，并查阅了相关真菌方面的文献，选择了有普遍代表的20条引物进行筛选，淘汰无扩增产物和多态性差的引物，选留扩增条带清晰且有明显多态性片段的引物8个(表2)。利用这些ISSR引物对27个供试菌株进行 PCR 分析。PCR扩增体系总体积为：25 μl，10×PCR buffer(含 Mg2+) 2.5 μl，10 mmol/L dNTP 0.5 μl，TaqDNA 酶0.5 μl，引物0.5 μl，模板 DNA 2 μl，ddH2O 19 μl。PCR 反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，45个循环；72 ℃ 10 min。将PCR样品加入 ABI377 DNA 测序仪上进行毛细管电泳，测序仪激光管开始收集条带。电泳结束后，打开胶图，即可分析结果，将胶图上出现DNA片段的计为1，不出现的计为 0，进行0～1数据统计，统计后输入电脑，用NT-SYS聚类分析软件体系进行聚类分析，并且构建遗传相关聚类图谱。

表1 杏鲍菇供试材料

表2 引物序列及编号

1.5 农艺性状分析

将27株杏鲍菇菌株分别接种于MYG液体培养基中，于25 ℃培养箱震荡培养制备液体菌种，每个菌株24瓶，接种于栽培袋中25 ℃恒温培养25 d，满袋后生理后熟10 d，进行搔菌处理，然后将其转移至14～16 ℃菇房中出菇。观察菌丝生长情况，记录满袋时间、原基形成时间以及子实体成熟时间，统计分析商品性状，包括菌盖直径、菌盖厚度、菌柄长度、子实体颜色以及产量。

2 结果与分析

2.1 体细胞不亲和性实验

27株供试菌株的拮抗反应结果见表3。由表3可知，LX2、LX21、LX24与其它菌株间有明显的拮抗现象，表明这3个菌株与其他菌株间具有较远的亲缘关系，为不同品种的菌株。

2.2 ITS序列分析

PCR产物通过1 %的凝胶电泳检测，得到清晰的目的条带，见图1。将27株供试菌株的PCR产物送金唯志测序，测序获得的ITS序列与NCBI中的杏鲍菇菌种的ITS序列进行BLAST序列比对，这27株供试菌株的序列与NCBI中的杏鲍菇序列相似度在99 % 以上，因此，在种的水平上证明这27株供试菌株为杏鲍菇。

2.3 毛细管电泳检测和扩增多态性分析

利用8 条引物对27株杏鲍菇菌株进行 PCR扩增，并对引物807的扩增片段进行了相关的数据分析(图 2)，通过检测发现引物807共扩增出条带36条，其中多态性条带34条，多态性比率94.4 %。剩余7个引物的毛细管电泳检测图片也具有较高的多态性。根据这些毛细管电泳检测图片，统计0～1数据表。将0～1数据用NT-SYS聚类分析软件体系进行聚类分析，构建遗传相关聚类图谱，见图3。当遗传相似性系数为0.87时，27株杏鲍菇菌株分为4类，其中LX10、LX21各为单独的1个类群，LX2、LX16、LX17为1个类群，其他菌株为1个大类群。当遗传相似性系数为0.876时，LX2、LX16、LX17又分为2个亚类群，其中LX2为单独的1个亚类群。

M:DNA分子量标准(100～2000 bp); 1～27: 供试样品名称(表 1)M: DNA marker (100-2000 bp); 1-27: The tested samples of P. eryngii(table 1)图1 ITS扩增产物 Fig.1 ITS amplified products

M: ROX 红色荧光标记的分子量标准(50～1000 bp); 1～27: 供试样品名称(表 1)M: ROX red fluorescent marker (500-1000 bp); 1-27: The tested samples of P. eryngii(table 1)图2 引物807 ISSR 扩增 Fig.2 ISSR amplified products by primer 807

图3 27个供试样品的ISSR聚类分析Fig.3 ISSR clustering analysis of 27 tested samples

2.4 杏鲍菇农艺性状评价

由表3可知，27株杏鲍菇菌株的生育期为 44～63 d，差异较大。根据生育期的长短，将生育期小于50 d的杏鲍菇，划分为早熟品种；生育期 50～55 d的为中熟品种；生育期大于55 d的为晚熟品种。其中，LX4、LX21 和 LX24 为早熟品种，LX21的生育期为 44 d，其满袋时间、原基发生时间以及子实体成熟时间均短于工厂化栽培品种LX4。LX3、LX6、LX8、LX10、LX16、LX20、LX23 为中熟品种，其它为晚熟品种。对27株杏鲍菇菌株的商品性状统计如图3、表4～5所示，27株杏鲍菇菌株在子实体大小、颜色等商品性状方面差异较大，具有丰富的遗传多样性。菌盖直径在2.2～7.64 cm 之间；菌盖厚度在0.97～2.88 cm 之间；菌柄长度在8.9～15.67 cm 之间。菌盖颜色分为浅棕色、淡黄色及灰褐色。各菌株间商品菇单产产量有着明显的差别。其中单产产量最高的菌株是杏鲍菇LX4，单个杏鲍菇产量达到197.5 g ，产量较低的是杏鲍菇LX2和LX16。菌株LX18虽然生育期时间较长，但其产量相对较高，并且其在生长过程中不易开伞；而菌株LX21虽然生育期最短，但是产量相对不高。因此，选择LX18与LX21 这2个性状优良且互补的菌株作为杂交的亲本，有利于培育出早熟、高产的优质杏鲍菇杂交新品种。

表3 不同菌株菌丝间的拮抗作用

3 讨 论

种质资源是遗传育种的原材料，是检测菌种质量好坏的重要因素，快速的菌种鉴定和保护为食用菌产业的良性发展奠定了基础[11]。在本研究中，菌株LX2、LX21及LX24与其余菌株间均形成较为明显的拮抗现象，表明这两株菌株与其它菌株亲缘关系较远，但是拮抗现象结果的判定易受主观因素影响，因此需要结合其他方法对杏鲍菇菌株的亲缘关系进行分析。因此本研究进一步利用ISSR分子标记技术对27株杏鲍菇菌株进行了进一步研究，试验结果表明，当遗传相似性系数为0.87时，27株杏鲍菇菌株分为4类，其中LX10、LX21各为单独的1个类群，LX2、LX16、LX17为1个类群，其他菌株为1个大类群。在拮抗实验中LX10与部分菌株无明显拮抗反应，但在ISSR分子标记中该菌株单独为1个类群，说明ISSR分子标记比拮抗试验更能精准反映菌株种间、种内的差异性。拮抗实验结果中LX24与所有菌株均有明显拮抗现象，但在遗传相似性系数为0.87时，该菌株被归为第1大类群，结果不一致，导致的原因可能是本研究中ISSR分子标记选取的引物数量较少，需要选取更多引物进行进一步验证。从遗传相关聚类图谱中可以看出，那些来自于不同地区的杏鲍菇菌株也被聚集到一个类群，这或许是因为在长期的驯化栽培以及引种试种过程中，因缺乏严格的菌种管理制度，出现“异种同名、同种异名”的现象，使得各个杏鲍菇品种间的遗传关系较小，本研究也从DNA水平证实了27株杏鲍菇菌株遗传基础比较集中。因此在以后的育种工作当中，亲本的选择应选用不同类群、遗传距离较远且综合性状优良的菌种为亲本，这样才有利于下一步杂交选育获得优势品种，扩大遗传基础。

图4 27株杏鲍菇子实体形态特征Fig.4 Fruiting body morphological characteristics of P. eryngii

表4 杏鲍菇生育期评价

表5 杏鲍菇商品性状比较

农艺性状统计结果表明，不同子实体间的表观特征差异较大，其中LX18为晚熟品种，产量较高，且不易开伞，LX21生长周期最短，但其在生长后期易开伞，产量不高，且根据拮抗试验和分子标记结果表明这2种菌株亲缘关系较远，可作为杂交育种的亲本，进一步培育开发早熟高产优良的新菌株。王波[12]的研究也表明将分子标记技术与农艺性状结果进行综合分析，是确定进行杂交育种的亲株，是获得优良菌株的有效方法。因此，本研究通过体细胞不亲和性、分子标记技术及农艺性状的比较分析，详细、系统的对杏鲍菇菌株进行种质资源的综合评价，全面准确的鉴定杏鲍菇菌株间的亲缘关系，筛选出了具有开发潜力的优良菌株作为下一步育种的试验材料，为加快推进杏鲍菇杂交育种的顺利进行打下坚实的基础。