标记免疫检验技术综述

杨丽霞

天津市静海区医院免疫科 （天津 301600）

标记免疫检验技术是指对已经确定好的抗原或抗体通 过物质进行标记，并通过测定标记物质的含量获得抗原-抗体的反应结果，进而准确求出检测抗原-抗体具体含量的一种技术，可以满足临床定性与定量分析的要求。标记免疫检验技术整个操作流程较为简单快捷，已被广泛应用于免疫检验工作中[1]。现阶段，临床所使用的标记免疫检验技术主要包括酶标记技术、荧光标记技术及化学发光标记技术等[2-3]。现将各种标记免疫检验技术的发展、特点及应用综述如下。

1 酶标记技术

酶标记技术的应用要追溯到1971年的酶联免疫吸附试验，通过此项试验，抗原抗体反应的特异性与酶对底物的高效催化作用被有效地结合起来，而且制备所得的酶标记物稳定性更好、保存时间更长[4]。按反应后的酶标记物是否分离结合和游离，可以将酶标记技术分为均相酶标记技术和异相酶标记技术两种。

均相酶标记技术是利用酶作为标记物，在均匀的液相中进行的免疫检验技术，该技术在应用过程中无需分离抗原抗体复合物，操作较为简单。酶扩大免疫检验技术及克隆酶供体免疫检验技术属临床上应用较为广泛的两种均相酶标记技术。酶扩大免疫检验技术以葡萄糖-6-磷酸脱氢酶作为标记酶，标记酶可以将底物辅酶转变为还原型辅酶，进而通过分光光度法进行测定。在克隆酶供体免疫检验技术中，游离的酶供体标记抗原可以与酶受体结合，结合后可以形成带有活性的全酶，且全酶活性与样品中的待测蛋白含量呈一定的比例关系，根据这种比例关系可以间接计算目标蛋白含量[5-6]。克隆酶供体免疫检验技术可用于血浆环孢菌素A 浓度的监测，具有操作简便、标本无需烦琐的前处理、精密度好、线性范围宽等优点，更便于临床实验室应用[6]。此外，均相酶标记技术在小分子抗原和半抗原的测定中应用较为广泛，如临床通过应用均相酶标记技术检测尿液中香草苦杏仁酸的含量来诊断嗜铬细胞瘤，同时，该技术还被用于霉酚酸血药浓度的测定中[7-8]。

异相酶标记技术是对分离的酶标记物和游离的酶标记物进行测定的一种技术，其特点在于标记的酶本身活性不会发生改变，相比于均相酶标记技术，异相酶标记技术的临床应用更加广泛。目前，酶联免疫吸附检验技术是临床上应用最为广泛的异相酶标记技术之一，主要用于传染病（如结核）和恶性肿瘤疾病（如肺癌）的诊断、血药浓度检测及食品安全评估等领域[9]。酶联免疫吸附检验技术所采用的微孔板具有良好的吸附性，各个孔之间的差异较小。带有琥珀酰亚胺酯活化的微孔板具有反应充分、使用方便快捷的优点。目前，日本所推出的AIA-1800和G7免疫分析系统具有较高的灵敏度，实际检测时间较短，线性范围较宽[10]。此外，近年来，临床所应用的放大系统使酶标记技术的灵敏度也得到了大幅提升，如底物循环、生物素-亲和素/链霉亲和素系统、酶-抗酶复合物系统、催化受体沉积技术、微颗粒放大技术等，尤其是催化受体沉积技术，可以避免酶和抗体的直接连接，体系的灵敏度可以被放大2个数量级[11-12]。在此基础上，异相酶标记技术逐渐开始与其他技术结合，如联合聚合酶链式反应技术的聚合酶链式反应-酶联免疫吸附测定技术、联合固相膜渗滤技术的斑点-酶联免疫吸附测定技术，这些联合应用的标记免疫检验技术避免了标记反应过程中酶活性的降低，且整个操作流程简单快捷，促进了酶免疫检验技术在深度与广度方面的发展，从而能够更好地为临床提供服务[13-15]。

2 荧光标记技术

20世纪90年代，荧光标记免疫检验技术在整个标记免疫检测方法学中占据着十分重要的地位，且发展十分迅速，同时其仍是目前标记免疫检验技术中最有发展前途的技术之一，被广泛应用于食品安全、血浆特定蛋白测定及血清肿瘤标志物的检测[16-17]。传统的荧光标记免疫检验技术常用有机荧光染料如四乙基罗丹明、异硫氰基荧光素等作为标记物，该测定方法极易受到散射光和背景荧光等因素的影响，分析灵敏度较低，临床应用范围受到一定的限制[18]。时间分辨荧光免疫检验技术所使用的标记物不再是有机荧光染料，而是铽、铕等标记抗体或抗原，铕可以在紫外光作用下产生较强的荧光且衰变时间较长（通常可达60～900 μs），该技术的特异度、灵敏度均较高，灵敏度甚至可达10-19mol/L 的水平[19-20]。荧光纳米微粒为一种应用于荧光标记的新型生物分子标记物，通过改变微粒直径可以获得不同颜色的材料，包被荧光微粒的微球可以作为固相反应载体和荧光亲和试剂，在信号检测中发挥十分重要的作用，该技术的灵敏度较高，其优势在于可以有效标记免疫球蛋白和转移蛋白，临床上可以用于C 反应蛋白检测[21-22]。近年来，多重荧光标记技术也被广泛应用于临床，该技术可以同时测定多个待测样本，大大提高了检测效率。此外，基于荧光标记技术所研发的试剂盒也逐渐被应用于临床，如DNA 核酸类、多肽和蛋白类荧光标记试剂盒等，上述试剂盒大多具有较高的检测灵敏度和特异度，市场应用前景良好。

3 胶体金标记技术

胶体金标记免疫检验技术以胶体金为标记物，固相载体则可以选用硝酸纤维素膜，继而形成红色免疫反应物质，并可被肉眼直接观察，因此，该技术可用于定性或半定量的快速免疫检测，临床应用更加方便，已被广泛应用于临床诊断与床边检测[23-26]。此外，胶体金标记的免疫反应简便快捷，其相关的试剂盒价格也较为低廉，可以更好地应用于传染病、药物滥用、肿瘤标志物、寄生虫及中药材活性成分等的检测[27]。

4 化学发光标记技术

化学发光标记技术是指在待检测的分子上连接可激活发光的化合物的方法。直接化学发光标记技术所测定的标记物质以吖啶酯类为主，其特点为不易受到外界因素的干扰，标记过程亦相对较为简单，临床上主要用于胆红素、维生素D 等的检测[28-29]。酶标记化学发光分析技术使用酶标记抗体或抗原后可以形成酶标记的抗原-抗体复合物质，可以催化化学发光底物发光，临床上大多用于甲状腺激素的检测，用以评估甲状腺功能[30-31]。电化学发光通过应用电促发光技术可以确保能量传递参与到化学反应中，如通过应用N-羟基琉酰胺酯标记抗体或抗原，可以使三丙胺参与到化学反应中，从而能够准确反映样品中抗原或抗体的含量，临床上大多用于乙肝表面抗原的检测，用于评价乙肝的感染情况[32-34]。

5 小结

近年来，随着临床免疫检验技术的不断发展，除了已得到广泛应用的酶标记技术、荧光标记技术、胶体金标记技术及化学发光标记技术外，以免疫浊度测定自动化和标记免疫测定自动化为主的标记自动化技术因应用更加方便、快捷而越来越被临床重视。业界后续仍需进一步加大对标记免疫检验技术的研究力度，以更好地服务于临床检验工作。