复方特比萘芬软膏微生物限度检查方法适用性试验研究

陈 静，严 佳，钟桂香，宋洪涛

(中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院，福建 福州 350025)

复方特比萘芬软膏是福州总医院自主研发制剂，适用于真菌性皮肤病。复方特比萘芬软膏的主药为特比萘芬和莫匹罗星。特比萘芬是一种广谱的烯丙胺类抗真菌药，对一些常见球形孢子丝菌、皮肤癣菌、裴氏着色真菌及某些酵母菌有抑制作用[1]。莫匹罗星是广谱类的抗菌药物，对各种革兰阳性球菌和某些革兰阴性菌有良好的抗菌作用[2]。特比萘芬和莫匹罗星联用有助于治疗合并细菌感染的浅部真菌感染。本文根据《中国药典》2015年版四部规定，参照菌数报告规则和微生物限度标准，通过摸索中和剂含量、薄膜过滤冲洗液体积、供试液稀释级及培养基稀释体积等方法对复方特比萘芬软膏进行处理以消除其抗菌性[4],建立复方特比萘芬软膏的微生物限度检查方法。结果表明，该方法科学、有效、可行。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

AE240精密电子天平(瑞士METTLER公司)；HWS24型电热恒温水浴锅、DHG-9145A电热恒温鼓风干燥箱、GHP-9160隔水式恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)；YP3001ND电子天平(上海精科有限公司)；MJPS-150型霉菌培养箱(上海精宏实验设备有限公司)； WJ-6无菌检查仪(天津市罗根科技有限公司)；SW-CJ-1B净化工作台(苏州太仓净化设备厂)；LDZX-40KBS立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)。

1.2 试药

复方特比萘芬软膏(批号：170913、171012、171114，规格：20g，联勤保障部队第900医院自制)。

1.3 培养基

胰酪大豆胨液体培养基(批号：1612071)、胰酪大豆胨琼脂培养基(批号：1610252)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(批号：1609214)、沙氏葡萄糖液体培养基(批号：1511162)、甘露醇氯化钠琼脂培养基(批号：1703202)、溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基(批号：160309)均购自北京三药科技开发公司。

1.4 稀释液及冲洗液

pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(批号：1709062，北京三药科技开发公司)；0.9%无菌氯化钠溶液(批号：170331，西陇科学股份有限公司)。均依照中国药典非无菌产品微生物限度检查1106项下稀释液配制方法配制。

1.5 试剂

聚山梨酯80(批号：20170925，国药集团化学试剂有限公司)。

1.6 菌株

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]、白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillusniger[CMCC(F)98003]，以上菌株均为第3代，均购自福建省药检所。

2 方法与结果

2.1 菌液制备

取经(30～35)℃培养18～24 h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌的胰酪大豆胨液体培养物各1ml和经(20～25)℃培养24～48 h的白色念珠菌的沙氏葡萄糖液体培养物1ml，加9ml 0.9%无菌氯化钠溶液，10倍递增稀释，制成适宜浓度的菌悬液[3]。

取经(20～25)℃培养7 d的黑曲霉沙氏葡萄糖琼脂斜面培养物，加5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱，并将孢子过滤至无菌试管内，取孢子液 1ml，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释，制成适宜浓度的菌悬液[3]。

2.2 供试液制备

从2两支供试品中各取5 g，共10 g，置于含熔化的8 g聚山梨酯80和玻璃珠的无菌锥形瓶中(温度≤45℃)，用无菌玻璃棒搅拌，加预先在40℃水浴保温的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml，搅拌混匀，作为1∶10供试液。从1∶10供试液中取50 ml、20 ml、10 ml，分别加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml，充分混匀，作为1∶20，1∶50，1∶100供试液。

2.3 回收比值的计算

试验组的回收比值=(试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数[4]

稀释剂对照组的回收比值=稀释剂对照组平均菌落数/菌液组平均菌落数

2.4 微生物计数方法适用性试验

2.4.1试验组

需氧菌总数计数：取供试液10ml(每膜)，经薄膜过滤后，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每次冲洗100 ml，冲洗次数不大于10次，在最后一次冲洗液中分别加入铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液1 ml，每1ml的菌悬液含菌数不大于100cfu(菌落形成单位)，混匀，过滤。将滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，35℃倒置培养3 d，计数。每株试验菌每种培养基平行制备两张滤膜。

霉菌、酵母菌总数计数：取供试液10 ml(每膜)，经薄膜过滤后，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每次冲洗100 ml，冲洗次数不大于10次，在最后一次冲洗液中分别加入白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液1 ml(含菌不大于100 cfu/ml)，混匀，过滤。将滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，25℃倒置培养5 d，计数。每株试验菌每种培养基平行制备两张滤膜。

2.4.2菌液组

取pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，按“2.4.1”项试验组操作加入试验菌液进行微生物回收试验。

2.4.3供试品对照组

取制备好的供试液，用pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液，其他操作同“2.4.1”项试验组。所用培养基及培养条件与试验组一致。

2.4.4稀释剂对照组

取含8%聚山梨酯80的pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，按“2.4.1”项试验组操作加入试验菌液进行微生物回收试验。所用培养基及培养条件与试验组一致。

2.4.5验证结果

首先选择1:10供试液采用薄膜过滤法(冲洗量1 000 ml)对需氧菌进行回收比值的测定，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉的回收比值低于0.5。接着，选择1∶50供试液对需氧菌检查计数方法重新验证。1∶50供试液采用薄膜过滤法(冲洗量1 000 ml)对需氧菌进行回收比值的测定，金黄色葡萄球菌的回收比值低于0.5，仍不符合要求。再后，进一步选择1∶100供试液，采用薄膜过滤法(冲洗量300 ml)对需氧菌进行回收比值的测定，结果见表1，5种试验菌种的回收比值均在0.5～2范围内，符合中国药典2015版四部通则1105微生物计数法的要求。取1∶100供试液10 ml，采用薄膜过滤法(冲洗量300 ml)可作为复方特比萘芬软膏需氧菌的计数方法。

霉菌、酵母菌总数计数结果见表2。1∶20供试液采用薄膜过滤法(冲洗量500 ml)对霉菌、酵母菌进行回收比值的测定，黑曲霉的回收比值低于0.5。因此，我们增大冲洗量，分别采用800 ml和1 000 ml进行冲洗，由表2可见，白色念珠菌和黑曲霉的回收比值均在0.5～2范围内，符合中国药典2015版四部通则1105微生物计数法的要求。从时间和经济成本考虑，取1∶20供试液10 ml，采用薄膜过滤法(冲洗量800 ml)作为复方特比萘芬软膏霉菌、酵母菌的计数方法。

表1 需氧菌总数验证结果与回收比值(1∶100供试液，300 ml冲洗，n=3)

表2 霉菌、酵母菌总数验证结果与回收比值(1∶20供试液，n=3)

2.4.6聚山梨酯80的含量考察

在微生物计数适用性试验中，以敏感菌金黄色葡萄球菌和黑曲霉作为试验菌考察不同浓度聚山梨酯80对抗菌活性的影响。按“2.2”项下要求制备供试液，分别加入4%、6%、8%和10%聚山梨酯80作为中和剂，需氧菌总数计数采用薄膜过滤法，取1∶100稀释级供试液10 ml进行冲洗，冲洗量为300 ml；霉菌及酵母菌计数采用薄膜过滤法，取1∶20稀释级供试液10 ml进行冲洗，冲洗量为800 ml。结果见表3，4%和6%聚山梨酯80未能达到药典规定(回收比值0.5～2)，而8%和10%聚山梨酯80均能达到药典规定，因此选择8%聚山梨酯80作为中和剂。

表3 聚山梨酯80的含量对金黄色葡萄球菌和黑曲霉回收比值的影响(n=3)

2.5 控制菌检查方法的验证

2.5.1铜绿假单胞菌检查方法的验证

试验组：取1∶10供试液10 ml，经薄膜过滤后，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每次100 ml，冲洗3次，在最后一次冲洗液中加入铜绿假单胞菌的菌悬液1 ml(含菌≤100 cfu/ml)，混匀，过滤。取出滤膜，加至100 ml的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，(30～35)℃培养24 h；取上述培养物划线接种于溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基中，(30～35)℃培养72 h。

阴性对照组：用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10 ml代替供试液，不加菌液，其他操作同试验组，按规定的培养条件培养。

菌液组：用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10 ml代替供试液，其他操作同试验组，按规定的培养条件培养。

供试品组：取pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1 ml代替菌液，其他操作同试验组，按规定的培养条件培养。

2.5.2验证结果

由表4可知，试验组和菌液组正常检出，阴性对照组和供试品组未检出，符合中国药典2015版四部通则1106控制菌检查的要求。取1∶10供试液10 ml，采用薄膜过滤法(冲洗量300 ml)，100 ml的胰酪大豆胨液体培养基进行增菌培养，可作为复方特比萘芬软膏铜绿假单胞菌的控制菌检查。

表4 控制菌铜绿假单胞菌检查适用方法验证结果

注：“—”代表无菌落生长；“+”表示有典型菌落生长

2.5.3金黄色葡萄球菌检查方法的验证

试验组：取1:10供试液10ml，经薄膜过滤后，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每次100 ml，冲洗10次，在最后一次冲洗液中加入金黄色葡萄球菌的菌悬液1 ml(含菌≤100 cfu/ml)，混匀，过滤。取出滤膜，加至不同体积的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，(30～35)℃培养24 h；取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基中，(30～35)℃培养72 h。

阴性对照组：取pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10 ml代替供试液，不加菌液，其他操作同试验组，按规定的培养条件培养。

菌液组：取pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10 ml代替供试液，其他操作同试验组，按规定的培养条件培养。

供试品组：取pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1 ml代替菌液，其他操作同试验组，按规定的培养条件培养。

2.5.4验证结果

由表5可知，培养基稀释体积为600 ml或以上时，试验组和菌液组正常检出，阴性对照和供试品组未检出，符合中国药典2015版四部通则1106控制菌检查的要求。取1∶10供试液10 ml，采用薄膜过滤法(冲洗1 000 ml)，600 ml的胰酪大豆胨液体培养基进行增菌培养，可作为复方特比萘芬软膏金黄色葡萄球菌的控制菌检查。

表5 控制菌金黄色葡萄球菌检查适用方法验证结果(n=3)

注：“—”代表无菌落生长；“+”表示典型菌落生长

3 讨论

复方特比萘芬软膏为半固体外用制剂，在缓冲液中的分散性较差，呈乳白色浑浊状，若直接进行薄膜过滤，易堵塞滤膜。适量浓度的聚山梨酯80具有中和、乳化、增溶的作用[5]。但浓度过高时，易堵塞滤膜，因此在稀释供试液时可将稀释液的温度升高至40 ℃，分次加入稀释液搅拌，可提高其溶解性，增加供试液的滤过性。通过本试验发现8%的聚山梨酯80不影响微生物生长繁殖，有助于提高供试液分散性，利于供试液的滤过。

复方特比萘芬软膏处方中含有特比萘芬、莫匹罗星等抑菌成分，因此该药抗菌谱广，对真菌和细菌都有很强的抑制作用[6-7]。通过试验可知，该药对5种试验菌株均有不同程度的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，对枯草芽孢杆菌和黑曲霉的抑制作用较强，对白色念珠菌和铜绿假单胞菌的抑制作用较弱。经过前期方法验证，单独使用平皿倾注法和薄膜过滤法均不能达到要求。通过试验证明，8%(g/ml)聚山梨酯80有效消除供试品的抑菌活性。聚山梨酯80可同时作为本供试品的乳

化剂和中和剂，简化检查方法，提高效率[8]。加入中和剂后，对冲洗液冲洗量和供试品稀释级进行进一步考察，以消除其抗菌活性为目的，最终筛选出最适合的方法[9]。

复方特比萘芬软膏对金黄色葡萄球菌的抑制作用强，因此在控制菌金黄色葡萄球菌检查中除了加入中和剂，还使用薄膜过滤法合并培养基稀释法以达到抗菌的作用。培养基稀释法利用减少单位体积内的供试品浓度以消除供试品抑菌作用，操作简便且不减少供试品检验量。培养基体积为600 ml或以上时，试验组显示金黄色葡萄球菌相应的反应特征。

《中国药典》2015版四部将加菌提前至供试液制备环节，更贴近药品在生产、贮存和运输过程中微生物污染的实际情况，提高试验的科学性[10]。但是莫匹罗星和特比萘芬的抗菌活性强，在供试液制备环节加菌无法达到规定的回收比值，所以选择在薄膜过滤冲洗后加菌。因此结合实际情况，对于抗菌活性强的药物，可以考虑经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再加入菌悬液。

4 结论

复方特比萘芬软膏的微生物限度检查方法为：需氧菌总数计数采用薄膜过滤法，取1∶100稀释级供试液10 ml进行冲洗，冲洗量为300 ml。霉菌和酵母菌总数计数采用薄膜过滤法，取1∶20稀释级供试液10 ml进行冲洗，冲洗量为800 ml。控制菌检查：采用薄膜过滤法，取1∶10稀释级供试液10 ml进行冲洗，冲洗量为300 ml，接种至100 ml胰酪大豆胨液体培养基培养，按照铜绿假单胞菌检查法检查；采用薄膜过滤法，取1∶10稀释级供试液10 ml进行冲洗，冲洗量为1 000 ml，接种至600 ml胰酪大豆胨液体培养基培养，按照金黄色葡萄球菌检查法检查。本方法科学准确，可为类似抗菌活性强的品种的微生物限度检查方法的设计提供参考。