形觉剥夺性高度近视豚鼠巩膜形态改变及缺氧诱导因子-1α和氧自由基在高度近视中的作用△

訾迎新 邓宇 冀美琦 秦亚丽 金明

形觉剥夺性近视(form deprivation myopia，FDM)学说创立于1977年，美国Wiesel教授等[1]缝合新生恒河猴的眼睑后，缝合眼产生明显的轴性近视。根据研究需要，有学者相继在树齁[2-3]、雏鸡[4]、小鼠[5]、大鼠[6]、豚鼠[7]等动物眼上开展近视的研究。研究证实对幼年动物施行形觉剥夺，被剥夺眼眼轴异常生长，形成明显近视[8-9]。近视的发生受遗传易感性与环境暴露等复杂因素的影响[10]，高度近视可因严重的并发症导致患者视力永久性损害，甚至失明，已经成为重要的社会、经济、公共卫生问题[11]。高度近视形成机制也非常复杂，Wu等[12]研究发现巩膜缺氧是近视的触发因素，巩膜由成纤维细胞与细胞外基质构成，细胞外基质重塑是玻璃体腔加深、眼轴变长的结构基础。本研究拟建立豚鼠FDM模型模拟高度近视状态，观察巩膜形态改变，测定巩膜中缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)相对表达量、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活力，探讨氧自由基与形觉剥夺性高度近视(form deprivation high myopia，FDHM)形成的关系，为进一步研究近视尤其是高度近视提供新的思路和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物取2周龄普通级三色健康豚鼠50只，体质量100～140 g，雌雄不限，购自北京科宇动物养殖中心[许可证号：SCXK(京)2017-0002]；本研究动物使用经伦理委员会同意(伦审号：180103)，且遵循ARVO关于眼科和视觉研究中对动物的处理原则。将豚鼠饲养于中国中医科学院中药研究所中心动物实验室[许可证号：SYXK(京)2016-0013]。饲养条件：室温25 ℃，空气相对湿度45%～50%，予以12 h光照(500 lux)，黑暗循环，实验期间所有豚鼠自由摄食、进水，并给予富含维生素的饲料及新鲜蔬菜等以补充维生素C。实验前检查所有豚鼠双眼前节和眼底，排除眼部疾病者。

1.1.2 主要仪器及试剂带状光检影镜(苏州六六视觉科技股份有限公司)，镜片箱(丹阳医疗器械厂)，A型眼科超声测量仪(ODM-1000，天津迈达医学科技有限公司)，抗鼠HIF-1α抗体(11000)(GB11031，Servicebio)，抗鼠ACTIN抗体(13000)(GB12001，Servicebio)，SOD检测试剂盒(KGT001100)、MDA检测试剂盒(KGT004)(北京百诺威生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 FDHM模型的建立和分组将豚鼠适应性饲养1周后，随机分为空白对照组(25只)和模型组(25只)。模型组豚鼠术前3 d双眼予5 g·L-1左氧氟沙星滴眼液滴眼预防感染，以4 mL·kg-1体质量标准腹腔注射100 g·L-1戊巴比妥钠，待麻醉满意后将豚鼠侧卧位置于操作台上，左眼予3.00 g·L-1卡波姆滴眼液滴眼防止角膜干燥，右眼予0.25 g·L-1庆大霉素生理盐水混合液冲洗结膜囊，左手持镊子轻轻提起上睑，右手持眼科剪从内眦部距睑缘2～3 mm处剪向外眦部，下睑操作同上，操作完成后，用5-0的丝线缝合豚鼠上、下眼睑，术后予4 g·L-1妥布霉素地塞米松眼膏涂眼。实验过程中每天检查眼睑缝线，一旦发现脱落，立即重新缝合。所有模型组豚鼠均选择右眼作为FDHM组，对侧眼为自身对照组。空白对照组豚鼠不做任何处理。

1.2.2 各组豚鼠屈光度及眼轴长度检测所有豚鼠在形觉剥夺前、形觉剥夺8周后进行散瞳验光。验光前以5 g·L-1复方托吡卡胺滴眼液充分散大瞳孔，麻痹睫状肌，采用带状光检影镜暗室下进行检影验光，每只眼重复测量3次取平均值，散光度以半数计入球镜度。以4 g·L-1盐酸奥布卡因滴眼液进行表面麻醉，A超测量眼轴各组成部分长度，本实验设置超声在眼内不同介质的传播速度：前房和玻璃体为1537 m·s-1，晶状体为1532 m·s-1。测量时探头垂直角膜平面，且尽可能对准瞳孔中心，不压迫角膜，取图形较稳定、清晰且晶状体后囊膜和视网膜双峰均高于基线为确定图像，每眼重复测量8次，取平均值。记录数据包括眼轴长度、前房深度(包括角膜厚度和前房深度)、玻璃体腔深度、晶状体厚度(眼轴长度减去前房深度和玻璃体腔深度)。

1.2.3 各组豚鼠眼巩膜的组织病理学观察形觉剥夺8周后以8 mL·kg-1体质量标准腹腔注射100 g·L-1戊巴比妥钠，过量麻醉处死空白对照组及模型组各10只豚鼠，摘取双侧眼球置于冰块上，沿角膜缘环形剪开眼球，去除眼前节及玻璃体。每组各取5只后段巩膜组织固定于40 g·L-1多聚甲醛溶液内，脱水，石蜡包埋，切片厚5 μm，进行HE染色，光学显微镜下观察巩膜组织着色情况；每组各取5只后段巩膜组织制作1 mm×1 mm眼球壁组织块，戊二醛溶液4 ℃冰箱固定24 h后，锇酸固定2 h，丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋，超薄切片(厚约500 μm)，醋酸铀、硝酸铅双重染色，透射电镜观察拍片。

1.2.4 Western blot检测HIF-1α蛋白相对表达量形觉剥夺8周后取每组各5只豚鼠，麻醉处死方法同上，剥离巩膜固定在液氮中，提取蛋白质，以BCA蛋白浓度测定试剂盒测定各样本蛋白浓度，沸水浴变性15 min，于-20 ℃冰箱保存备用，选择100 g·L-1不连续SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，进行转膜。将转好的膜于室温下脱色摇床上用50 g·L-1的脱脂牛奶，封闭1 h。加入11000的抗鼠HIF-1α抗体，4 ℃孵育过夜，将二抗用TBST稀释3000倍，室温下孵育30 min后，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次5 min，加入化学发光试剂进行曝光、显影。以Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值，以抗鼠Actin抗体(13000)作内参，计算目的蛋白的相对表达量(目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/Actin条带灰度值)。

1.2.5 比色法检测SOD的活力及MDA的含量形觉剥夺8周后，麻醉处死每组各10只豚鼠，用显微镊剥离巩膜，以精密分析天平称巩膜湿重，加双蒸水，以1 mL预冷的试剂匀浆成100 g·L-1的匀浆液。3000 r·min-1离心匀浆液5 min，取上清液待检测。参照SOD活力检测试剂盒要求，使用96孔板设置样品孔和空白对照孔，依次加入待测样品和其他各种溶液，加入反应启动工作液后充分混匀，37 ℃孵育30 min，在波长450 nm处测定吸光度，参考说明书上的公式计算SOD活力；参考MDA试剂盒标准管吸光度，取0.1 mL标准品，标准管吸光度减去标准空白管吸光度为0.103～0.112，严格按说明书上的公式计算MDA含量。

1.3 统计学方法使用SPSS 22.0统计学软件进行分析，本研究中计量资料以均数±标准差表示。FDHM组与空白对照组间比较采用两因素方差分析，FDHM组与自身对照组比较采用配对t检验。FDHM组豚鼠巩膜组织中SOD活力、MDA含量的关系采用Pearson线性相关分析，并对相关系数进行假设检验。采用双侧检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组豚鼠眼球屈光状态的变化豚鼠出生时均为远视眼，3 周龄豚鼠的眼球屈光度约为+3.50 D，形觉剥夺前各组间屈光度差异均无统计学意义(均为P>0.05)。形觉剥夺8周后，FDHM组屈光度高于空白对照组和自身对照组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；三组远视屈光度均降低，向近视发展，屈光度高于形觉剥夺前，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。见表1。

表1 各组豚鼠形觉剥夺前后屈光度的变化

注：与空白对照组比较，*P<0.01；与自身对照组比较，#P<0.01；与形觉剥夺前比较，△P<0.05

2.2 豚鼠眼球A超检测结果形觉剥夺8周后，FDHM组玻璃体腔深度、眼轴长度均高于空白对照组和自身对照组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；三组豚鼠玻璃体加深、眼轴增长，均高于形觉剥夺前，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。各组间的前房深度、晶状体厚度在形觉剥夺前后比较，差异均无统计学意义(均为P>0.05)。见表2。

表2 各组在形觉剥夺前后A超测量参数的变化

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与自身对照组比较，#P<0.05；与形觉剥夺前比较，△P<0.05

2.3 光镜观察结果空白对照组豚鼠眼巩膜厚度正常，成纤维细胞核染呈蓝紫色，梭形或长圆形，细胞外基质呈粉红色，胶原纤维排列整齐，走行正常，直径均匀；FDHM组豚鼠巩膜明显变薄，成纤维细胞核扭曲变形，胶原纤维分布稀疏，直径明显减小，排列紊乱、扭曲，有断裂、分离现象，纤维间空隙增大，细胞外基质增多。自身对照组巩膜厚度稍变薄，但形态未见明显异常。见图1。

2.4 电镜观察结果巩膜组织由纤维母细胞和与眼球壁平行的胶原束堆积而成，其中胶原纤维构成巩膜组织的框架。观察胶原纤维横断面直径，空白对照组和自身对照组巩膜无明显差别；而FDHM组胶原纤维直径显著减小，密度降低。见图2。

2.5 各组豚鼠巩膜HIF-1α的表达情况Western blot检测结果显示，与空白对照组、自身对照组相比，FDHM组巩膜HIF-1α蛋白表达升高。FDHM组巩膜HIF-1α蛋白的相对表达量为0.70±0.15，空白对照组和自身对照组分别为0.10±0.06、0.36±0.08，FDHM组与空白对照组和自身对照组比较，差异均有统计学意义(均为P<0.01)。

2.6 各组豚鼠巩膜中SOD活力和MDA含量SOD活力与脂质过氧化物的主要产物MDA的含量呈相反的变化趋势。正常情况下，即空白对照组中巩膜的SOD保持高活力，而MDA处于低水平。形觉剥夺8周后，FDHM组巩膜SOD活力低于空白对照组和自身对照组，MDA含量高于空白对照组和自身对照组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。见表3。

图1 光学显微镜下各组豚鼠巩膜形态HE染色 (×400)

图2 电镜下各组豚鼠巩膜超微结构变化 (×5000)

表3 各组豚鼠巩膜SOD活力和MDA含量

注：与空白对照组比较，*P<0.01；与自身对照组比较，#P<0.05

3 讨论

由于豚鼠的屈光状态、正视化机制与人类相似，豚鼠出生时为远视眼，3周内眼轴迅速增长，11周时屈光状态稳定在轻度远视眼，完成正视化过程，豚鼠FDM模型已广泛应用于近视的实验研究[13-14]。研究显示：形觉剥夺以后，角膜变平，前房加深，晶状体增厚，眼轴增长，远视屈光度下降[15]。本研究采用3周龄的豚鼠进行造模，此时豚鼠处于视觉发育的关键时期，对造模比较敏感，通过延长形觉剥夺时间，旨在造成高度近视状态[16]。生理条件下，巩膜组织不断接受外来光线刺激而发生光氧化作用，促进氧自由基形成，同时细胞内存在有效的抗氧化物质如SOD等可及时清除氧自由基，使氧自由基的生成与降解处于动态平衡，HIF-1α作为维持氧稳态的主要调节因子，为巩膜等组织提供了保护作用。病理情况下，氧自由基生成过多或机体抗氧化能力不足，可引发脂质过氧化反应，其主要代谢物MDA能引起细胞和组织的损伤。MDA的含量反映机体细胞受氧自由基攻击的程度；SOD是机体重要的抗氧化酶，其活力反映机体清除氧自由基的能力[17-18]。本研究结果显示，FDHM眼巩膜中HIF-1α、MDA含量升高，SOD活力降低。

本研究结果显示，对豚鼠眼睑缝合进行形觉剥夺8周后，近视屈光度加深，最高可造成-8.00 D屈光状态；A超进行生物测量显示形觉剥夺8周后豚鼠玻璃体腔延长、眼轴变长，表明高度近视造模成功；自身对照眼与空白对照眼相比，所有参数差异无统计学意义，表明形觉剥夺眼不会干扰对侧眼的自然发育，与Zhao等[19]研究结果一致。FDHM眼巩膜形态发生病理性改变，巩膜变薄、胶原纤维直径变小，与对照组巩膜比较，粗纤维缺乏，纤维间区域增大，胶原纤维分布排列缺乏梯度变化，推测可能与近视巩膜细胞外基质蛋白多糖的合成速率低于胶原纤维的形成有关。