固相微萃取法优化沙琪玛气味物质的萃取条件

尤梦晨 杨 平 宋焕禄* 张晓莹 廖勇诚

（1 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心 北京工商大学分子感官科学实验室 北京100048 2 雀巢研发（中国）有限公司 北京100095）

沙琪玛也称为“萨其马”、“沙其玛”等，是一种源于满族的中国特色糕点。做法是将面条炸熟后，用糖混合成小块制成，也是北京著名京式四季糕点之一，具有色泽米黄，口感酥松绵软，香甜可口，桂花蜂蜜香味浓郁的特点[1]。

长期以来，沙琪玛被大众所喜爱，且销售市场越来越广[2]。目前国内有关于沙琪玛关键活性气味物质的分析与研究，如：王彦蓉等[3-4]对沙琪玛贮存过程中风味变化及品质改善的研究，还有少量报道是针对不同种类原材料对沙琪玛品质影响的研究[5-12]。然而，沙琪玛中除了一些令人愉悦的蛋香气味之外，还有一些令人不愉快的异嗅味。为了能更好地找出沙琪玛中有关鸡蛋的风味物质及一些生产或贮存过程中产生的异嗅味，本试验采用固相 微 萃 取 法 （Solid -phase -micro -extraction，SPME）[13-17]和气相色谱-嗅闻-质谱法（Gas chromatography-olfactrometry-mass spectrometry，GCO-MS）[18-24]结合技术对萃取条件进行优化，从而找出沙琪玛中存在与鸡蛋风味有关物质和异嗅物，以改善产品的质量。王彦蓉等[17]曾用固相微萃取与气质联用的前处理方法对沙琪玛中风味成分进行萃取，鉴别出了沙琪玛中的37 种挥发性风味化合物。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市售沙琪玛。正己烷（色谱纯），英国Fisher Scientific 公司；氦气（99.999%），北京氦普北分气体工业有限公司；2-甲基3-庚酮 （0.816 μg/μL），美国Sigma 公司。

1.2 仪器与设备

固相微萃取手动进样手柄、75 μm CAR/PDMS 萃取头、CAR/PDMS/DVB 萃取头，美国Supelco 公司；固相微萃取顶空瓶 （100 mL），美国QEC 公司；HH-1 恒温水浴锅，国华电器有限公司；微量注射器（10 μL）、7890A/7000B 气相色谱-三重四级杆质谱联，美国Agilent 公司；JA5003 电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；DBWAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）色谱柱、DB-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）色谱柱，美国J & W 公司；嗅闻仪Sniffer 9000，瑞士Brechbühler 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备 取7 g 沙琪玛样品放入气相顶空瓶中，用微量注射器吸取9～10 次正己烷进行洗针，吸取预先配制好的0.816 μg/μL 的1 μL 2-甲基-3-庚酮于样品中，拧紧瓶盖。萃取条件：萃取温度70 ℃，水浴平衡20 min，插入SPME 纤维头，顶空萃取40 min。萃取完毕后，将SPME 纤维头插入气相色谱仪进样口，于250 ℃条件下解吸5 min。

1.3.2 定量分析 在色谱分析中常用到的定量分析方法有归一化法、内标法、外标法和标准物加入法。本试验选用的是内标法作为定量分析[25]。

选用质量浓度为0.816 μg/μL 的2-甲基-3-庚酮作为内标，将配好的1 μL 2-甲基-3-庚酮溶液加入待平衡的样品中。化合物含量计算如式（1）：

式中，Sa——样品a 的峰面积；Ss——内标物的峰面积；Cs——内标物质量浓度，μg/μL。

1.3.3 气相色谱-嗅闻-质谱联用分析 色谱条件：色谱柱：DB-WAX 型 （30 m×0.25 mm，0.25 μm）毛细管柱；载气：高纯氦气（99.999%）；恒流模式，流量：0.7 mL/min；进样口温度：250℃；进样模式：分流（分流比10∶1）；色谱柱升温程序：初始温度40 ℃，保持时间10 min，以12 ℃/min 升至190℃，保持2 min，再以6 ℃/min 升至225 ℃，保持1 min，最后以6 ℃/min 升至250℃，保持2 min，总运行时间为41 min。

质谱条件：质谱条件为电子轰击离子源（Electron impact，EI），电子能量70 eV，传输线温度250 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，采集方式：全扫描（All scan）；扫描质量范围40～300 m/z。

1.3.4 单因素试验 对固相微萃取的萃取头（PDMS/CAR，CAR/PDMS/DVB），样品量（6，7，8，9，10 g），平衡时间（10，15，20，25，30 min），吸附时间（30，35，40，45，50 min） 及 萃 取 温 度（50，60，70，80，90 ℃）做单因素试验，初步找到最优试验条件。通过GC-O-MS 技术，根据在嗅闻口闻到气味的出峰时间以及在NIST 库中检索，找到既可以被质谱分离又可以在嗅闻口闻到的19 种关键气味物质，最后运用内标法，根据出峰面积及内标物浓度，计算出以上气味物质的浓度，再计算出总浓度进行比较从而初步找到最优萃取条件。

1.3.5 响应面分析 在单因素试验的基础上，运用响应面法优化固相微萃取法（SPME）萃取沙琪玛中蛋香和蛋腥气味活性化合物条件，最终得到最优萃取条件。通过单因素试验，确定了沙琪玛样品量、试验温度、吸附时间及平衡时间4 个单因素的最优条件，各个因素间或多或少会存在相互影响，为确定这4 个因素之间的最佳比例，根据Box-Behnken 试验设计原理，采用4 因素3 水平响应面分析方法，固相微萃取后的气味活性化合物含量作为响应指标（Y）。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 萃取头的选择 选用2 种固相微萃取头 （即CAR/PDMS/DVB 萃取头和75 μm CAR/PDMS萃取头）萃取沙琪玛的挥发性风味物质，结果如图1和图2所示。从图中可以看出，CAR/PDMS/DVB萃取头所检测出的色谱峰的数目要多于75 μm CAR/PDMS 萃取头，且出峰密集，峰面积大，有较好的萃取效果。

2.1.2 样品量的选择 选择样品量6，7，8，9，10 g 进行单因素试验，得到沙琪玛中具有蛋黄和蛋腥味的风味物质总含量如下图所示，从图3中可以明显看出，在样品量大于等于9 g 时，主要风味物质总含量明显下降，分析原因可能是样品量过多导致风味物质挥发不完全。样品量为7 g 时，所需要的风味物质总含量最高，因此选择样品量7 g为最优条件。

2.1.3 平衡时间的选择 选择平衡时间10，15，20，25，30 min 进行单因素试验，测得平衡时间与主要风味物质的总含量关系如图4所示。从图4看出，不同平衡时间与主要风味物质总含量之间变化不大。平衡时间为20 min 时，得到的风味物质总含量最高，因此确定平衡时间20 min 为最优条件。

2.1.4 吸附时间的选择 选择吸附时间30，35，40，45，50 min 进行单因素试验，测得吸附时间与主要风味物质的总含量关系如图5所示。从图5看出，吸附时间过短导致风味物质吸附不完全，吸附时间为40 min 时，得到的风味物质总含量最高，因此确定吸附时间40 min 为最优条件。

图1 CAR/PDMS/DVB 萃取头的色谱图Fig.1 Chromatogram of CAR/PDMS/DVB extraction fibers

图2 75 μm CAR/PDMS 萃取头的色谱图Fig.2 Chromatogram of 75 μm CAR/PDMS extraction fibers

图3 样品量与主要风味物质总含量之间的关系Fig.3 The relationship between the amount of sample and total concentration of main flavor substances

2.1.5 萃取温度的选择 选择萃取温度50，60，70，80，90 ℃进行单因素试验，测得萃取温度与主要风味物质的总含量关系如图6所示。从图6看出，萃取温度过高，部分风味物质挥发，因此萃取温度为70 ℃时，得到的风味物质总含量最高，因此确定萃取温度70 ℃为最优条件。

图4 平衡时间与主要风味物质总含量之间的关系Fig.4 The relationship between the equilibrium time and total concentration of main flavor substances

图5 吸附时间与主要风味物质总含量之间的关系Fig.5 The relationship between the adsorption time and total concentration of main flavor substances

图6 温度与主要风味物质总含量之间的关系Fig.6 The relationship between the extraction temperature and total concentration of main flavor substances

2.2 响应面优化萃取条件

选择浓醇鸡蛋味沙琪玛为试验材料，采用固相微萃取法直接萃取颗粒态样品，选择气相进样口分流比10∶1 的条件下操作，纤维涂层材料的萃取头为CAR/DVB/PDMS （碳分子筛/二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷），样品量为6，7，8 g，温度为60，70，80 ℃，吸附时间为35，40，45 min，平衡时间为15，20，25 min，试验因素与水平见表1。

试验的设计及结果见表2，其中交叉试验24 个，零点试验6 个，估计试验误差。

表1 Box-Behnken 试验因素及水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

表2 Box-Behnken 设计表及试验结果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

根据试验结果，使用Design-Expert 8.0 对表2中数据进行多元回归拟合，得到沙琪玛中蛋香和蛋腥气味物质的总含量对样品量（A）、平衡时间（B）、吸附时间（C）、吸附温度（D）的二次回归方程模型为：Y=612.29-43.29A-20.07B+11.46C+125.26D+18.87AB+0.11AC+31.04AD-58.12BC-31.30BD-27.49CD-88.54A2-153.11B2-72.60C2-78.19D2。

设计中均经过量纲编码线性处理，因此各系数的正负以及绝对值大小直接反应了各因素对响应指标的影响程度。对回归模型进行方差分析，结果见表3。

表3 响应面回归模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

回归模型整体为极显著（P=0.0003<0.001），回归模型的失拟项不显著（P=0.2907>0.05），说明该模型拟合度好，是可信的，可以用此模型检验使用固相微萃取（SPME）提取沙琪玛中蛋香和蛋腥气味物质的效果，探究因素的最优响应水平。通过软件分析该回归模型，R2=0.9578，R2Adj=0.9123，说明相应指标的变化有95.78%来源于优化的因素因子，即样品量、吸附温度、吸附时间和平衡时间，回归方程与实际值具有很高的拟合性，因此回归方程可以代替真实值解释响应指标结果。由表3可知，所选因素中吸附温度D 对萃取效果极为显著，样品量A 对萃取效果高度显著，样品量A2、平衡时间B2、吸附时间C2、吸附温度D2的二次项对萃取效果高度或极显著，两两因素交互，即平衡时间与吸附时间BC 对萃取效果影响显著。说明吸附温度以及样品量对SPME 的提取挥发性气味物质萃取效果影响显著，而平衡时间和吸附时间对萃取效果影响不显著，交互项样品量与平衡时间、样品量与吸附时间及样品量与吸附温度等对SPME萃取效果影响不显著，说明这些条件的影响效果并不是简单的线性关系。

通过Design-Expert 8.0 得出响应曲面的形状，响应面的立体图如图7～12 所示，可以较直观的看出各因素对响应指标的影响，以及最优和最佳因素水平。

图7是萃取时间为40 min，温度为70 ℃时，样品量和平衡时间对总含量影响的响应曲面，随着平衡时间的延长，总含量不断增加，随着样品量的增多，总含量变化不大。图8～12 分别是样品量和吸附时间，样品量和吸附温度，平衡时间和吸附时间，平衡时间和吸附温度以及吸附时间和吸附温度对峰总面积影响的响应曲面。

根据Design-Expert 8.0 中的优化选项的数字功能，运用最大值优化法，在模型范围中选择最低点为出发点，优化得到SPME 提取风味化合物的最佳条件为样品量6.74 g，平衡时间19.80 min，吸附时间40.20 min，吸附温度73.9 ℃，预测该种条件下测得气味活性化合物的总含量是652.919 ng/g。采用上述最优萃取条件做验证试验，萃取的挥发性化合物的总含量为633.88 ng/g，与预测值相差较小，说明该模型较优化所得的萃取气味化合物的参数可信度高，准确可靠，具有实用价值。考虑到实际情况，对萃取条件略微进行调整，样品量7 g，平衡时间20 min，吸附时间40 min，吸附温度70 ℃。

图7 样品量和平衡时间对总含量影响的响应曲面及等高线图Fig.7 Response surface and contour map of the influence of sample amount and equilibrium time on the total concentration

图8 样品量和吸附时间对总含量影响的响应曲面及等高线图Fig.8 Response surface and contour map of the influence of sample amount and adsorption time on the total concentration

3 结论

本试验主要运用固相微萃取法的前处理方法，利用气相色谱-嗅闻-质谱联用（GC-O-MS）技术对沙琪玛中蛋香和蛋腥味气味物质进行检测。为更好的达到找寻沙琪玛中蛋香和蛋腥味气味物质的效果，本试验首先对沙琪玛的萃取头涂层、平衡时间、萃取时间、萃取温度及样品量做单因素试验，初步找到最优条件，即选用沙琪玛浓醇鸡蛋味为试验样品，选用3 涂层的CAR/PDMS/DVB 萃取头，用固相微萃取的方法直接萃取颗粒状样品，气相分析分流比10∶1 检测。在单因素试验的基础上，通过响应面分析法得到最佳萃取条件为：平衡时间20 min，萃取时间40 min，萃取温度70 ℃，样品量7 g。为下一步沙琪玛生产及贮藏过程中关键气味活性化合物的定性、定量分析打下了基础，以便于分析其变化规律，达到从风味入手进行品控的目的。

图9 样品量和吸附温度对总含量影响的响应曲面及等高线图Fig.9 Response surface and contour map of the influence of sample amount and extraction temperature on the total concentration

图10 平衡时间和吸附时间对总含量影响的响应曲面及等高线图Fig.10 Response surface and contour map of the influence of equilibrium time and adsorption time on the total concentration

图11 平衡时间和吸附温度对总含量影响的响应曲面及等高线图Fig.11 Response surface and contour map of the influence of equilibrium time and extraction temperature on the total concentration

图12 吸附时间和吸附温度对总含量影响的响应曲面及等高线图Fig.12 Response surface and contour map of the influence of adsorption time and extraction temperature on the total concentration