老年带状疱疹后神经痛病人外周血Th17/Treg细胞及相关细胞因子的表达*

陈晓彤 王 蕊 常 敏 孙明洁 王 昕 于 洋 王清义 陈付强△

（1济宁医学院，济宁272067；2青岛市市立医院疼痛科，青岛市疼痛临床研究治疗中心，青岛266011；3青岛市妇女儿童医院新生儿重症监护室，青岛266011）

带状疱疹后神经痛 (postherpetic neuralgia, PHN)定义为带状疱疹 (herpes zoster, HZ) 皮疹愈合后持续1个月及以上的疼痛[1]，是带状疱疹最常见的并发症[2]。PHN是最常见的一种神经病理性疼痛，可表现为持续性疼痛,也可缓解一段时间后再次出现[3]。PHN的发生随年龄的增加而增加[4,5]，病人可因长期慢性疼痛而导致抑郁，甚至自杀，这给老年人的晚年生活健康蒙上阴影。因为PHN的发病机制尚不明确，无法用单一原因解释其发生，所以针对PHN这种典型的神经病理性疼痛目前还没有有效、快速的治疗方法。研究表明PHN的发生与机体细胞免疫紊乱、被异常抑制相关[6,7]，Treg细胞属于辅助性T淋巴细胞，是一类特异性表达叉头状转录因子或翅膀状螺旋转录因子(fork head box P3, Foxp3)具有主动抑制效应的T细胞(effector T cells)，发挥免疫抑制、维持免疫耐受[8]，是发挥免疫负调控功能主要的T淋巴细胞亚群。Th17细胞是一类介导炎症反应的T细胞亚群，可以刺激多种炎性因子的合成，诱导局部炎症反应，调节体液免疫中抗体的合成。Th17及Treg细胞及其相关细胞因子在免疫性疾病、肿瘤、感染性疾病等多种疾病中起到重要作用［9～12］。同时，两种细胞在各自分化、对免疫系统功能的调节方面既密切联系，又相互制约。Luchting等对26名患有神经性疼痛病人的T细胞亚群的一项研究发现，与健康对照组相比，神经性疼痛病人存在TH17/Treg失衡，表现为抗炎性Treg细胞增加，促炎性Th17细胞减少[13]，然而国内对此两种细胞及其相关细胞因子是否参与PHN的机制研究较少，因此本研究检测老年PHN病人外周血中Th17/Treg细胞及相关细胞因子的表达水平，旨在探讨Th17/Treg细胞在PHN病程中的作用机制，以期对临床诊治提供新的研究方向和可靠的实验依据。

方 法

1.一般资料

本研究符合本单位的伦理学标准并得到批准，且已得到病人与家属的知情同意，并与病人及家属签署知情同意书。

入选标准：符合PHN诊断标准，年龄≥65岁，视觉模拟评分(visual analogue scale, VAS) 均在7 分以上，言语上无障碍，能够理解、接受VAS评估，无严重的内科疾病，在过去的一个月内，没有使用糖皮质激素和免疫抑制剂，也没有使用其它一些可影响T淋巴细胞亚群的药物。

排除标准：伴有严重心、肺、肾等系统性疾病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病的病人和应用免疫抑制剂的病人，以及精神病病人或不合作者。

选取2017年3月至2018年3月山东省青岛市市立医院疼痛病房PHN病人60例，皮损及疼痛区域神经支配范围 C3-L2, 左头面部4例，右头面部3例，左上肢5例，右上肢4例，左胸背部19例，右胸背14例，右腰臀部7例，左下肢2例，右下肢2例。年龄65～88岁，平均年龄73.7岁， VAS平均为8.62分，其中男26例，女34例。收集其入院时的血标本。健康对照组30例，为本院门诊同期健康体检者，年龄65～86岁，平均年龄73.4岁，男14例，女16例。病例组与对照组在性别、年龄等方面差异无统计学意义(P＞ 0.05)。

2.主要试剂及仪器

小鼠抗人单克隆抗体(CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5)、同型对照抗体以及抗人Foxp3-PE、 Foxp3固定破膜工作液：法国Immunotech公司；红细胞裂解液(Optilyse C)法国Immunotech公司；人白介素6(IL-6)酶联免疫吸附测定试剂盒、人白介素10 (IL-10)酶联免疫吸附测定试剂盒、人白介素17 (IL-17)酶联免疫吸附测定试剂盒、人白介素35 (IL-35)酶联免疫吸附测定试剂盒、人肿瘤坏死因子(TNF-α)酶联免疫吸附测定试剂盒：大连宝生物工程有限公司；流 式 细 胞 仪 (Epics XL·MCL)： 美 国 BECKMAN COULTER公司；低温高速离心机：德国Heraeus公司；37℃恒温箱：北京福意电器有限公司；Varioskan Flash全波长扫描式多功能读数仪。

3.方法

标本收集：无菌条件下采集病例组和对照组清晨空腹静脉血8 ml，5 ml置于肝素钠抗凝管中，加入等体积PBS稀释后采用人淋巴细胞分离液密度梯度离心法获取外周血单个核淋巴细胞。另3 ml置于干燥管中，室温静置1 h，3 500 rpm离心5 min，获取血清，贮存于-70℃ 冰箱中保存，用于后续ELISA检测。

血清细胞因子检测：空白孔中加标准品和样品稀释液100 μl，余孔中加标准品或待测样品100 μl，混匀，覆膜，37℃孵育90 min，用洗涤液洗涤检测板3次，每次均用吸水纸拍干；每孔加酶结合物工作液100 μl，覆膜，37℃孵育60 min；用洗涤液洗涤检测板5次，吸水纸拍干；每孔加底物溶液90 µl，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15 min；每孔加终止液50 μl，混匀；用450 nm波长读取吸收值，绘制标准曲线。

Treg细胞检测：单个核淋巴细胞PBS重悬，调节PBMC浓度为1×106个/ml左右。每管加入200 μl制备好的单个核细胞悬液及20 μl CD4-FITC/CD25-PE混合液，4℃避光孵育30 min；经流式染色缓冲液洗涤后，加入1 ml Fixation/Permeabilization 破膜缓冲液，4℃避光孵育45 min；用破膜缓冲液洗涤2次，加入20 μl Foxp3-PE-Cy5（同型对照管加入20 μl IgG2a-PE-Cy5），4℃避光孵育30 min；经破膜缓冲液洗涤2次，用500 μl流式染色缓冲液重悬，上机检测，荧光数据的获得以荧光强度＞ 3 000个个体细胞为阳性,结果最终以每个细胞的平均荧光强度表示。

Th17细胞检测：单个核淋巴细胞PBS重悬，调节PBMC浓度为1×106个/ml左右。其后按流式检测试剂盒说明书操作，依次加入固定液、破膜剂，抗体混合液，每种试剂加入后均按说明进行避光，孵育、离心，洗涤。用500 μl流式染色缓冲液重悬，上机检测，荧光数据的获得以荧光强度 ＞ 3 000个个体细胞为阳性,结果最终以每个细胞的平均荧光强度表示。

4.统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件，数据以均数±标准差(±SD)表示，两组间比较采用t检验。P＜ 0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1.老年PHN病人外周血中Th17细胞百分比降低、Treg细胞百分比升高及Th17/Treg比值降低

老年PHN组Th17细胞表达(0.46±0.48)%、对照组(0.67±0.79)%；老年PHN组Treg细胞表达(3.62±1.25)%、对照组(1.31±1.04)%；老年PHN组Th17细胞百分比显著降低，Treg细胞百分比显著升高，Th17/Treg比值显著降低，说明老年PHN病人存在Th17/Treg比例失衡现象（见表1）。图 1为对照组与老年PHN病人外周血Treg细胞的流式细胞结果图。图 2 为对照组与老年PHN病人外周血Th17细胞的流式细胞结果图。

表1 老年PHN病人与对照组外周血Th17及Treg细胞的百分比及Th17/Treg比率结果(±SD)Table 1 Frequency of Th17，Treg and Th17/Treg ratio at elder patients with PHN (±SD)

表1 老年PHN病人与对照组外周血Th17及Treg细胞的百分比及Th17/Treg比率结果(±SD)Table 1 Frequency of Th17，Treg and Th17/Treg ratio at elder patients with PHN (±SD)

*P ＜ 0.05，与对照组相比 *P ＜ 0.05，compared with control group.

组别Group 例数Number CD4+IL-17+ CD4+CD25+Foxp3+ Th17/Treg对照组Control 30 0.67±0.79 1.31±1.04 45.63±0.28病例组Patient 60 0.46±0.48* 3.62±1.25* 23.18±0.23*

2.老年PHN病人血清中IL-6、IL-17降低，IL-10、TNF-α升高

首先绘制标准曲线，标准品终浓度分别为0、50、100、250、500、1000 pg/ml，曲线拟合适配度(R Square)均在95%以上（见图3）。与对照组相比，老年PHN病人血清中IL-6、IL-17的水平显著降低(3.36±0.48vs.5.57±0.79、2.43±0.28vs.4.18±0.23,P＜ 0.05)，IL-10、TNF-α 水平显著升高（5.34±1.25vs.2.38±1.04、5.41±3.22vs.2.56±1.24，P＜ 0.05，见图 4）。

讨 论

PHN往往表现为持续而剧烈的烧灼样痛或间断性电击样疼痛，同时伴随多种感觉异常或缺失，睡眠可以短暂的减轻疼痛的强度，但情绪激动，环境温度的升高，以及劳累都会加重疼痛的强度，严重妨碍了病人机体功能状态，同时也降低了病人生活的质量，老年人尤为严重。研究表明PHN的发生与机体细胞免疫功能紊乱、被异常抑制有关[14,15]。

Treg是一种具有免疫抑制活性的CD4+T细胞亚群，Treg通过释放细胞因子IL-10和TNF-α发挥抑制T细胞及抗原呈递细胞的功能，上调抑制性免疫细胞表面分子表达和下调活化T细胞的相关基因表达，发挥免疫调节作用，维持免疫耐受，预防自身免疫性疾病的发生。Th17细胞是一种介导炎症反应的CD4+T细胞亚群，Th17细胞通过分泌炎性细胞因子IL-17等，可对体内中性粒细胞的活化、动员起到介导作用，促进机体的炎症反应，与多种自身免疫性疾病的发生关系密切。Th17细胞 和Treg细胞在功能上相互拮抗，在分化发育过程中密切相关[16]，即机体在免疫稳定时，免疫系统产生的TNF-α抑制效应T细胞生成，促进Foxp3+Treg分化，维持自身耐受[17]；在感染或炎症浸润时，激活的固有免疫系统产生IL-6促进Th17细胞诱导的炎症反应，并抑制TNF-α介导的Treg细胞生成[18]。Th17/Treg细胞保持动态平衡，在机体免疫防御、免疫稳定维护中发挥重要作用。 促炎性Th17细胞与抑制性Treg细胞的比例失衡是很多炎症及自身免疫性疾病发生发展的一个关键因素。

图1 对照组与老年PHN病人外周血Treg细胞的流式细胞结果图Fig.1 The flow cytometric histogram of elderly patients with PHN and healthy control Treg staining

图2 对照组与老年PHN病人外周血Th17细胞的流式细胞结果图Fig.2 The flow cytometric histogram of elderly patients with PHN and healthy control Treg staining

图3 四种细胞因子的标准曲线图Fig.3 Standard curves of four kinds of fl ow cytokines

图4 老年PHN病人与健康对照组IL-6, IL-10, IL-17,TNF-α的水平(pg/ml,±SD)Fig.4 Expression of IL-6, IL-10, IL-17, TNF-α in elderly patients with PHN and healthy control (pg/ml,±SD)*P ＜ 0.05，与对照组相比；*P ＜ 0.05，compared with control group.

本研究以老年PHN病人为研究对象，检测病人外周血中Th17、 Treg细胞及其相关细胞因子的表达水平，探讨其病程中此两种细胞是否存在数量变化及失衡情况。结果显示，外周血中 CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的比例升高，其相关细胞因子IL-10、TNF-α也相应升高，由此推测，VZV感染机体可诱导Treg细胞活化、增殖，及分泌抑制性细胞因子TNF-α，抑制机体的抗病毒免疫应。老年PHN 病人体内由于CD4+CD25+Treg 表达量增高，免疫抑制功能增强，引起特异性细胞免疫，下调机体抗病毒免疫反应,这在PHN发病机制中起着重要作用。本小组前期研究发现老年PHN病人较健康对照者外周血中CD4下降，CD4/CD8下降，Treg表达增高，且PHN的严重程度和Treg表达呈正相关[15]。Ahmad Bayat等研究表明PHN病人外周血中存在抗干扰素 α (IFN-α)、抗干扰素 γ (IFN-γ)、及抗IL-6的自身抗体，并且以上抗体水平均较正常人增高[19]；Luchting等[13]研究发现，神经性疼痛病人存在TH17/Treg失衡，表现为抗炎性Treg细胞增加，促炎性Th17细胞减少，Treg相关的FoxP3和TGF-βmRNA表达升高，而Th17相关的RORγT的表达降低，但细胞因子IL-6、IL-10和IL-17与健康对照组相比并无明显差异。本研究结果表明，Th17细胞在老年PHN病人的外周血中低表达，促进其分化的IL-6及其分泌的IL-17 相应降低，可能的原因是老年PHN病人TNF-α显著升高，而高水平的TNF-α可以诱导Treg细胞的生成，而增高的 Treg有可能抑制Th17细胞的分化，从而发挥免疫抑制作用。由此得出：Th17细胞及Treg细胞在免疫调节功能中互相拮抗与制约，两者平衡状态决定了疾病的发展方向，而Th17/Treg细胞比率失衡可能是老年 PHN病人病程迁延不愈的一个重要原因。

综上所述，机体免疫组织、免疫细胞和免疫分子构成一个复杂的免疫调节机制，而Th17和Treg细胞在其中起着重要的调节作用。Th17/Treg细胞比率失衡在 PHN 疾病进展中起重要作用，但PHN时T淋巴细胞亚群间究竟如何相互作用尚不清楚，Th17 是否通过转录因子IL-6-RORγt、STAT3的介导和相关细胞因子间的相互作用使细胞的信号转导通路发生改变，进而作用于靶器官，影响Th17细胞与Treg的分化和表达，改变机体的免疫平衡状态，导致免疫抑制改变，还需要我们更进一步的阐明。