升陷汤及各单味药对阿霉素致心肌细胞损伤的保护作用

满 缓，张 凤，黄豆豆，熊筱娟，詹 勤，廖丽娜，李铁军，陈万生

(1.海军军医大学附属长征医院药材科，上海 200003；2.宜春学院化学与生物工程学院，江西 宜春 336000; 3.海军军医大学药学院药理教研室，上海 200433)

阿霉素属于蒽环类抗癌药[1]，对白血病、前列腺癌、肝癌等实体瘤有非常明确的疗效[2]，但在临床应用中会产生心脏毒性的副作用，随着使用剂量的增加，可使得心肌产生不可逆性损伤，最终发展成为充血性心力衰竭[3]。近年来对阿霉素所致心脏毒性的机制考察主要着重于自由基、钙超载、细胞凋亡和线粒体损伤等方面[4]。已有实验结果显示，阿霉素可使心肌细胞内活性氧含量增加[5]。有学者研究表明，阿霉素可使心肌细胞中钙离子浓度升高，从而导致细胞形态学发生改变[6]，但阿霉素的心脏毒性机制尚未有明确的定论[7]。如何在应用阿霉素治疗肿瘤时又能减少其心脏毒性，寻找对其有效的防护药物，具有重大临床意义。

升陷汤为近代著名中医学家张锡纯先生所创，记载于《医学衷中参西录》，组方配比为黄芪∶柴胡∶升麻∶知母∶桔梗=6∶1.5∶1∶3∶1.5[9]。方中生黄芪补气升陷为主药，知母凉润制主药之温燥，柴胡、升麻助黄芪升陷之力，桔梗载药力上达胸中，共奏升补大气之效[10]。目前临床用于治疗冠心病心绞痛、慢性充血性心力衰竭、病毒性心肌炎等疾病，应用十分广泛[12]。但尚未见应用于阿霉素或其他抗肿瘤药物心脏毒性的治疗，故本实验采用阿霉素诱导心肌细胞损伤模型，考察升陷汤及各单味药对阿霉素心脏毒性的影响。

1 材料和仪器

1.1 实验动物

采用3 d的SD乳鼠(雌雄不限)，购于上海斯莱克实验动物有限公司，动物饲养于第二军医大学实验动物中心SPF级实验室，常规饲养条件饲养。许可证号SYXK(沪)2007-0005，所有实验动物均获得第二军医大学动物伦理委员会的准许。

1.2 实验试剂与仪器

黄芪、知母、柴胡、升麻和桔梗饮片(上海长征医院药材科)；Milli-Q纯净水(美国Millipore)；Fura-2/AM(中国科学院上海生理所)；生理盐水(上海长征医院提供)；0.25%胰蛋白酶(美国Gibco公司)；高糖DMEM培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(FBS)及小牛血清(FCS，美国Gibco公司)；MTT工作液(美国sigma公司)；二甲基亚砜(德国GmbH公司)；LDH试剂盒(南京建成公司)；DCFH-DA、Fluo-3 AM(碧云天生物有限公司)；D-Hanks缓冲液(上海研卉生物科技有限公司)；PBS缓冲液(南京滴纯生物科技有限公司)；其他试剂为分析纯。

多功能酶标仪(美国Multiskan MK3)；倒置荧光显微镜(重庆光学仪器)；低温冰箱(海尔集团)；荧光显微镜(日本Olympus公司)；CO2细胞培养箱(德国Heraeus公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；无菌操作超净台(苏州净化设备公司)；LD4-2型离心机(北京医用离心机厂)；79-1型磁力搅拌器(江苏周庄科研仪器厂)；YJ-II型超声波细胞粉碎机(上海新芝生物技术研究所)。

1.3 样品制备

1.3.1升陷汤全方提取物(药物SXT)

升陷汤组方饮片(黄芪600 g，知母300 g，柴胡150 g，桔梗150 g和升麻100 g)，先加入5 L的水浸泡24 h后，再煎煮，重复3次，将浓缩水煎煮液合并至650 ml，按原生药量将浓度记为2.0 g/ml。水煎液放置在4 ℃冰箱，冷藏备用。

1.3.2单味药材提取物

升陷汤组方各单味药材，制备方法同“1.3.1”，得黄芪(药物A)、知母(药物B)、柴胡(药物C)、桔梗(药物D)和升麻(药物E)提取物。

2 试验方法

2.1 原代心肌细胞的提取和纯化

参考文献的制作方法[13]，取出生1～3 d的SD乳鼠，先用75%的酒精消毒，在无菌条件下开胸取出心脏，放入预冷的1×D-Hanks缓冲液中，洗涤2～3次，取心尖部组织剪为1 mm3左右的碎块，加入不含乙二胺四乙酸(EDTA)的0.08%胰蛋白酶溶液消化7 min，待自然沉淀后弃上清液一次，以后每次取上清液，加含20%FBS的DMEM培养基终止消化。重复此步骤直至组织块消化完全。中和的上清液1 500 r/min离心10 min，弃上清液，用培养基再洗一遍，1 000 r/min离心5 min。弃上清液，用含10%的FBS和10%的FCS的DMEM培养基重悬后，采用差速贴壁法纯化细胞2次，每次45 min，取细胞悬液，铺板，每毫升细胞数5×105。铺板，放入5% CO2培养箱中培养，隔天更换培养液，培养直到心肌细胞出现自发搏动。

2.2 阿霉素心脏毒性模型复制和药物干预

收集生长健康的心肌细胞随机分为8组。正常对照组(Con 组)，健康的心肌细胞；模型组(M组)，用阿霉素终浓度500 ng/ml，孵育24 h造心肌细胞损伤模型；药物干预组(SXT、A、B、C、D和E)，用阿霉素终浓度500 ng/ml，孵育24 h造心肌细胞损伤模型，在孵育的同时加入升陷汤全方提取物、各单味药材提取物，药物浓度分别为75 μg/ml和150 μg/ml。

2.3 指标检测

2.3.1药物对阿霉素损伤心肌细胞活力的影响

细胞铺96孔板培养，2～4 d后，心肌细胞基本全部跳动，按照实验分组分别加入含有不同浓度药物的培养基培养24 h后，取出每孔加入MTT(5 mg/ml)应用溶液20l，37 ℃继续孵育4 h，终止培养，取出去除培养基，加入150l的DMSO，用酶标仪充分震荡5 min，在492 nm波长下读数，测定各孔吸光度OD值。细胞存活率=(试验组光吸收值/对照组光吸收值)×100%。

2.3.2药物对阿霉素损伤心肌细胞LDH的影响

细胞铺96孔板培养，2～4 d后，心肌细胞基本全部跳动，按照实验分组分别加入含有不同浓度药物的培养基培养24 h后，吸出100l培养液，放入到一新的96孔板相应孔中。按照试剂盒说明书分为空白孔、标准孔、药品孔、对照孔，在不同相应的对照孔中加入不同的试剂(双蒸水、0.2 mmol/L标准液、待测药物组、基质缓冲液、辅酶I)，混匀，37℃温浴15 min，之后加入2,4-二硝基苯肼25l，混匀，37 ℃温浴15 min，再加入0.4 mmol/L NaOH溶液250l，混匀，室温放置5 min，用酶标仪在450 nm波长下读数，测定各孔吸光度OD值。计算公式：细胞上清液中LDH活性(U/L)=(测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度(0.2 mmol/L)1 000。

2.3.3药物对阿霉素损伤心肌细胞内活性氧和钙离子浓度的影响[14]

原代心肌细胞内活性氧水平和钙离子浓度检测分别采用多功能酶标仪检测荧光探针ROS(DCFH-DA)和钙离子浓度(Fluo-3 AM)的荧光强度。细胞铺96孔板培养，2～4 d后，心肌细胞基本全部跳动，按照实验分组分别加入含有不同浓度药物的培养基培养24 h后，去除培养基，加入稀释好的含有DCFA-DA(Fluo-3 AM)的无血清的DMEM，37℃继续孵育30～60 min后，用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，在多功能酶标仪激发波长488 nm，发射波长525 nm下检测细胞内荧光。以模型组为对照组，其余组与模型组的比值为其相对荧光数值。

2.3.4统计学处理方法

3 实验结果

3.1 升陷汤及各单味药对阿霉素致心肌细胞损伤的影响

MTT结果显示阿霉素刺激心肌细胞24 h后，能显著降低细胞活力。当同时给与升陷汤及各单味药治疗后，在浓度为75g/ml时，升陷汤全方以及黄芪、知母、桔梗单味药能够显著增强细胞活力，与模型组比较，差异具有统计学意义；柴胡、升麻单味药虽也增加了细胞活力，但与模型组比较差异不明显，无统计学意义；在浓度为150g/ml时，与模型组比较，升陷汤及各单味药均能够显著增强细胞活力，差异具有统计学意义。结果表明在75g/ml、150g/ml浓度时，升陷汤全方以及各单味药对阿霉素致心肌细胞损伤具有一定保护作用(图1)。

图1 升陷汤全方及各单味药对阿霉素致心肌细胞损伤模型的影响 *P<0.05与模型组比较；##P<0.01与正常组比较

3.2 升陷汤及各单味药对阿霉素致心肌细胞损伤的细胞内钙离子浓度的影响

结果显示：与正常组相比，阿霉素能够显著增强心肌细胞内钙离子的浓度，差异具有统计学意义。与模型组相比，当给予升陷汤及各单味药治疗后，在药物浓度75g/ml时，除升陷汤全方，各单味药均可以降低细胞内钙离子浓度，差异具有统计学意义；在药物浓度150g/ml时，升陷汤全方和各单味药均可以降低细胞内钙离子浓度，差异具有统计学意义。表明升陷汤全方及单味药可以降低阿霉素引起的心肌细胞内升高的钙离子浓度，具有保护心肌细胞损伤作用(图2)。

3.3 升陷汤及各单味药对阿霉素致心肌细胞损伤的细胞内LDH含量的影响

结果显示：与正常组相比，阿霉素能够显著增强心肌细胞LDH浓度，差异具有统计学意义。与模型组相比，当同时给予升陷汤及各单味药治疗后，在浓度为75g/ml、150g/ml时，升陷汤全方及各单味药(除黄芪外)均能够降低细胞LDH的含量，差异具有统计学意义。表明升陷汤全方及单味药对阿霉素致心肌细胞损伤具有保护作用(表1)。

图2 升陷汤全方及各单味药对阿霉素致心肌细胞损伤的细胞内钙离子的影响 *P<0.05，**P<0.01，与模型组比较；##P<0.01，与正常组比较

3.4 升陷汤及各单味药对阿霉素致心肌细胞损伤的细胞内ROS含量的影响

结果显示：与正常组相比，阿霉素能够显著增强心肌细胞内ROS的浓度，差异具有统计学意义。与模型组相比，当同时给予升陷汤及各单味药治疗后，在药物浓度75g/ml时，升陷汤、知母和柴胡可以降低细胞内钙离子浓度，差异明显；在药物浓度150g/ml时，升陷汤、黄芪、知母、柴胡可以降低细胞内ROS，差异具有统计学意义，桔梗、升麻对ROS的浓度无影响(图3)。

表1 药物对阿霉素致心肌细胞损伤LDH的影响

*P<0.05，与模型组比较；##P<0.01，与正常组比较

图3 升陷汤全方及各单味药对阿霉素致心肌细胞损伤细胞内ROS的影响 *P<0.05、**P<0.01，与模型组比较；##P<0.01，与正常组比较

4 讨论

蒽环类药物为临床上抗肿瘤常用的药物，对血液系统以及各种实体瘤有较好的治疗效果[15]，阿霉素是其代表药物，已广泛应用于临床上一些癌症的治疗，并取得了显著的疗效，延长了患者的生命，并提高了其生活质量，但阿霉素带来的心脏毒性、骨髓抑制、消化道损伤等副作用，使得阿霉素的临床应用受到一定限制[16]。其中，由于阿霉素与心肌细胞具有较高的亲和力，其导致的心脏毒性也成为最严重的毒性反应[15]。阿霉素进入体内后，一方面，在线粒体和微粒体中导致一系列的自由基和超氧化物的生成，可与体内的有机物及一些生物膜发生反应，从而改变生物膜的流动性，进而损伤细胞的功能[4]，另一方面，可引起心肌细胞内钙离子升高，从而造成心肌细胞代谢紊乱以及能量代谢障碍。

临床上升陷汤广泛用于冠心病、心绞痛的治疗，慢性充血性心力衰竭、病毒性心肌炎等疾病[17]，但升陷汤所带来的心肌细胞损伤也不容忽视。有报道称，心肌细胞内ROS含量增加，会降低细胞的抗氧化能力[18]，会产生细胞的凋亡[19]。LDH含量的增加提示，心肌细胞在使用阿霉素的情况下，发生了细胞的过氧化过程，而LDH的含量也是对心肌细胞损伤的提示[20]。Ca2+的增多，会使心肌细胞内Ca2+超载，产生心律失常[21]。

本课题通过体外细胞实验从阿霉素致心肌细胞损伤，基于心肌细胞凋亡角度考察，证实了升陷汤以及各单味药的保护作用，可通过降低细胞内ROS、LDH水平以及Ca2+的浓度实现，在早期阿霉素治疗中如果应用升陷汤，一定程度上能降低阿霉素的心脏毒性作用。在本次实验中升陷汤全方在降低细胞内ROS、LDH和提高生存率方面明显强于其他任何单味药材处理组，部分证实了升陷汤全方治疗“大气下陷”的合理性，但实验中缺少对不同药材组合的考察去证实君臣佐使的配伍机制，需要在后期实验进行弥补。本实验结果为阿霉素导致的心脏毒性提供了新的治疗思路，但离体实验与在体情况仍有许多差别，实验结论还需进一步在在体实验中证实。