包埋活性污泥实现短程硝化微生物结构特点

文_赵昕燕 北京节能环保中心

与全程硝化相比,短程硝化可减少硝化过程25%的需氧量和反硝化过程中40%的碳源消耗量,同时具有较低的污泥产量,并且可减少反硝化池容积,成为近几年新型生物脱氮工艺的研究热点。短程硝化是通过控制各种影响因素的方式促进AOB的生长繁殖同时抑制NOB的生长,达到缩短反应时间,节约能源的目的。但作为自养型细菌，AOB生长缓慢,容易从反应器中流失,在连续流条件下NO2--N积累不稳定,限制了短程硝化技术的应用。

包埋固定化微生物技术是现代生物工程领域中的一项新兴技术,它以高分子材料为载体,将游离细胞或者酶定位于限定的区域,使其保持活性并可反复利用,具有良好的微生物截留效果。

通过包埋固定化技术制作短程硝化包埋菌颗粒能有效防止菌体流失,提高细菌生物量,同时加强系统的抗负荷冲击能力,有利于短程硝化的稳定运行，活性污泥成本较低,且容易获得,适合进行包埋固定化。近来各国对包埋短程硝化的研究兴趣逐渐向微观方面转移，由原来探索水利条件来获取最佳的处理效果转为对微观结构等方面的研究探讨。应用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE)对环境微生物进行研究,可以不经过培养直接从环境样品中提取细菌的DNA或RNA,利用DNA或RNA的微生物遗传特性进行表征,这样不但避免了传统上耗时的菌种分离,更可进而鉴定出无法用传统方法分离出来的菌种,克服了传统微生物分类鉴定方法的不足。

1 材料与方法

1.1 样品采集

连续流试验采用2L有机玻璃反应器,如图1所示,实验采用人工配水培养包埋污泥,进水水质指标如表1所示。

表1 人工模拟废水成分组成

试验用包埋污泥取自北京某污水处理厂二沉池,取出的污泥经4000r/min转速离心浓缩10min,弃清液,得浓缩污泥。以质量百分比计,取10%的水性聚氨酯(WPU)溶液与等体积浓缩污泥混合,加入0.24%N,N-亚甲基双丙烯酰胺和1.5%过硫酸钾(KPS),并迅速搅拌,约30min后混合液凝胶成固态,将固态胶体切割成3×3×3mm立方体,既得包埋固定化颗粒,将制得的包埋颗粒活化培养一周后备用.包埋剂(WPU)和交联剂/引发剂(N,N-亚甲基双丙烯酰胺、KPS)均为分析纯。

在连续流试验条件下,进水NH4+-N质量浓度为60mg/L,通过缩短反应器水力停留时间(HRT)的方式,反应器中逐渐出现NO2--N的积累,至第26天,反应器中的NO2--N积累率达到65.1%,氨氮去除率达到95.7%,之后NO2--N积累率和氨氮去除率都呈缓慢上升趋势,至第60天,反应器中的NO2--N积累率达到79.3%,出水NH4+-N质量浓度为1.86mg/L,氨氮去除率达到96.9%,基本所有NH4+-N都转化为NO2

--N,反应器达到稳定的短程硝化。本研究中充分曝气,水中DO一直维持在4mg/L以上, 并通过水浴控制反应器内温度,保持在室温21℃左右,进水氨氮浓度较低,只有60mg/L,游离氨(FA)不会成为主要的NOB抑制因素,在以往活性污泥法的研究中,这些条件都不是利于形成短程硝化的因素。但在本研究中,控制反应器HRT在2h,之后逐渐降升高至4h,同样形成了稳定的短程硝化,因此分别在连续流试验各个阶段取样,进行分子生物学分析,研究包埋菌形成稳定短程硝化的内在原因。

分子生物学取样,第一个样取自包埋前活性污泥,第二个样取自连续驯化第26天,第3个样取自连续驯化第60天。分别编号为样品R1(接种污泥)、R2(驯化中的短程包埋硝化污泥)和R3(稳定短程包埋硝化污泥)，样品采集后在-20℃下保存。

1.2 样品总DNA提取

采用上海生工提供的“Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒(土壤)”提取DNA后,取5μL提取的DNA用1.2%琼脂糖凝胶检测。

1.3 聚合酶链式反应(PCR)

针对总细菌的PCR扩增,以提取的总DNA作为模板,采用对大多数细菌16S rRNA基因V3区都具有特异性的引物对F357-GC(5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCG CCGCCCCCGCCCCCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和R518(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')。

1.4 变性梯度凝胶电泳(DGGE)

采用DCodeTM基因突变检测系统(Bio-Rad,USA)对PCR扩增产物进行分离。

1.5 克隆与测序

对DGGE电泳后图谱上的优势条带进行切胶回收。对于选定的每个条带,只选择其中间部分进行切割。

1.6 样品的生物多样性分析

采用凝胶分析软件Quantity One对扫描所得的DGGE图谱进行分析。

2 结果与讨论

2.1 污泥样品总DNA提取和PCR扩增结果

污泥样品提取的DNA经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测,得到的总DNA片段大小约为23kbp,属于比较完整的细菌总DNA,适合做下一步PCR扩增。针对总细菌16S rRNA基因的PCR扩增结果大约为240bp,符合预期的长度,适合做下一步DGGE.针对AOB 16S rRNA基因的PCR扩增结果大约为500bp(第一轮)和250bp(第二轮),符合预期的长度,适合做下一步DGGE。

2.2 DGGE指纹图谱结果

根据DGGE技术原理,图谱中分离出来的条带都是不同种类的微生物的特定区的DNA片段,每个条带原理上可以代表一个微生物种属,条带信号强度越大表示该细菌在污泥中的优势地位越大,且相同位置电泳条带较多,表明优势的微生物数量很多且相似性很高。图2和图3分别代表了针对总细菌和AOB的16S rRNA基因所得DGGE图谱。

2.3 细菌种群多样性

总细菌种群结构多样性特性如图4所示。可以看出：三个样品中稳定短程硝化污泥对应的样品R3的SDI和EI均最高,分别为1.69和0.70,表明稳定短程硝化污泥中微生物种群相对丰富并且分布均匀；驯化期的短程硝化污泥对应的样品R2的SDI和EI均最低,分别为0.62和0.32,包埋颗粒在固定化过程中由于包埋试剂的毒性、聚合反应的热效应等因素会导致刚包埋完成的颗粒活性较低,表明短程包埋硝化污泥的驯化过程会淘汰部分种群从而降低污泥中微生物种群的多样性。

AOB种群结构多样性特性如图5所示。可以看出：三个样品中接种污泥多样性指数、均匀性指数均最低,表明接种污泥AOB种群多样性低,分布集中。驯化中的短程硝化污泥和稳定短程硝化污泥均较接种污泥多样性指数、均匀性指数高,表明稳定短程硝化污泥可以富集AOB,这为包埋污泥能够维持稳定的短程硝化提供了微生物学基础。

2.4 特征条带的回收测序和系统发育分析

将总细菌和AOB的DGGE图谱中部分优势条带进行切胶测序,在Genbank中进行比对,获得各条序列的同源性信息，从总细菌部分条带16S rDNA序列比对结果可以看出,本次试验3个样品中的微生物群落主要分布于变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和未培养菌(uncultured bacterium)。3个样品的共有条带中,条带1和条带3分别与Nitrosomonas europaea(KF618624.1)和 Nitrosomonas sp. (KP074927.1)同源性达到94%和96%,亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)在反应器内将氨氧化为亚硝酸盐,作为短程硝化系统中的优势菌群已经见诸多报道；条带2和条带5分别与Uncultured bacterium(HQ015447.1)和Uncultured bacterium(GQ421116.1)同源性达到99%和94%,表明短程硝化系统中的细菌多样性丰富,并潜藏着许多未被人们认识的微生物新资源,有待于进一步深入研究；条带6与Alcaligenes sp. (LN864598.1)的同源性达到了98%,多项研究表明产碱杆菌属细菌Alcaligenes sp.具有聚磷能力；条带9与Flavobacterium sp. (KT284905.1)的同源性达到92%, Flavobacterium被报道具有广泛的溶藻能力。这几种细菌存在于接种污泥、驯化中的短程硝化污泥和稳定短程硝化污泥中,表明其具有较强的环境适应能力,而他们具有的脱氮功能、聚磷功能和溶藻功能都是水处理中功能菌的生化特性。条带10存在于样品R1和样品R3中,与Thiobacillus(NR_074417.1)的同源性达到90%,该菌是一类硫自养反硝化菌,它具有不需要投放有机物作为碳源和产生极少量的污泥等优点。

从AOB部分条带16S rDNA序列比对结果和图7的AOB系统发育树可以得到本研究中分离到的亚硝化细菌(AOB)均与β-Proteobacteria的亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)有着较高的相似性(90%～99%),而没有与亚硝化螺菌属(Nitrosospira)有一定相似性的序列,已有研究证实绝大多数的生物反应器里Nitrosomonas是AOB中的优势菌属,而Nitrosospira只出现在个别反应器里。

3 结论

（1）短程硝化逐渐稳定的过程会增加微生物种群多样性,影响污泥稳定性的细菌被淘汰,而脱氮菌、聚磷菌、溶藻菌和硫自养反硝化菌等污水处理功能微生物都在反应过程中得到保留。经包埋固定化稳定短程硝化污泥比活性污泥更能有效防止菌体流失,提高细菌生物量。不同阶段培养的污泥相比,稳定短程硝化污泥微生物种群多样性丰富、分布均匀,而驯化中的短程硝化污泥微生物种群多样性较低、分布集中。3个样品中的优势菌群主要分布于变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和未培养菌(uncultured bacterium)。

（2）短程硝化过程实现了对AOB一定程度的富集,与接种污泥相比,驯化中的短程硝化污泥和稳定短程硝化污泥中AOB的多样性指数、均匀性指数均有提高,其中稳定短程硝化污泥中的AOB多样性指数和均匀性指数最高、接种污泥中AOB的多样性指数和均匀性指数最低。包埋材料具有良好的截留微生物的能力,对于那些世代周期较长的微生物如亚硝酸菌提供了较好的环境。AOB种群分析表明优势AOB均属于亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas),且出现在短程硝化不同阶段的不同菌种,表明该反应器污泥内部形成的不同环境条件能够为多种AOB提供生存环境。